0. TL; DR

本文利用DNA甲基化谱分析训练了三种不同的机器学习方法来区分转移性头颈部鳞状细胞癌HNSC和第二原发性肺鳞状细胞癌LUSC。在一个包含279名HNSC和LUSC患者以及正常肺组织对照的验证队列中，正确分类了96.4%的病例。

通过对分类结果的概率分数设置阈值并排除低置信度的样本，能够为大部分病例实现超过99%的预测准确率。作为该方法的独立临床验证，分析了51名有HNSC病史并出现第二个肺部肿瘤的患者系列，结果显示分类结果与临床病理学特征相符。

1. 背景介绍

头颈部鳞状细胞癌（HNSC）患者的预后主要受远处转移的限制，其中肺部是最常见的转移部位。然而，由于这两种癌症具有相似的流行病学和风险因素（如吸烟），这些患者同时也有很高的风险发生第二原发性肺鳞状细胞癌（LUSC）。

更复杂的是，HNSC的肺转移灶和原发性LUSC在组织形态学和免疫组化特征上常常难以区分。因此，当一名有HNSC病史的患者被诊断出肺部有鳞状肿瘤时，在许多情况下无法确定这究竟是HNSC的转移还是一个独立的原发性肺癌。

区分这两种疾病至关重要，因为它直接决定了治疗策略和患者的预后。HNSC的远处转移通常被认为是无法治愈的，患者主要接受姑息性化疗或放疗。而局限性的LUSC患者则通常有资格接受包括肺叶切除术在内的根治性治疗。

近年来，虽然有一些基于二代测序（NGS）、RNA测序或蛋白质组学的方法被提出，但它们存在局限性。例如，基于突变谱的比较需要有原始的HNSC肿瘤组织，并且可能因肿瘤异质性而失败。而基于RNA或蛋白质组学的特征分析，其准确率低于90%，难以在常规诊断中应用。

DNA甲基化谱在不同组织类型中具有高度特异性，这为癌症分类提供了新的可能。基于此，作者旨在开发一种基于DNA甲基化和机器学习的分类器，以解决区分HNSC肺转移和原发性LUSC的诊断难题。

2. 机器学习分类器的开发

作者采用了系统的方法来开发和验证分类器，主要包括队列构建、数据分析和三种机器学习模型的训练与比较。

2.1 队列构建与数据来源

参考队列 (Reference Cohort)：用于训练模型。该队列包含来自The Cancer Genome Atlas (TCGA) 和 Gene Expression Omnibus (GEO) 数据库的1071个样本，包括原发性HNSC、原发性LUSC和正常肺组织。加入正常肺组织是为了识别那些因邻近肺组织污染而导致肿瘤细胞含量低的样本。
验证队列 (Validation Cohort)：用于评估模型性能。该队列包含来自六个不同GEO数据集和作者所在机构档案的279个独立样本。
临床队列 (Clinical Cohort)：用于最终的临床验证。该队列包含51名有HNSC病史并出现第二个肺部肿瘤的患者，这些病例的最终诊断是基于全面的临床病理学信息，由多学科肿瘤委员会讨论确定的。

2.2 数据分析与特征选择

作者首先对参考队列的DNA甲基化数据进行了非监督分析。t-SNE分析结果显示，HNSC和LUSC样本虽然大致分为两组，但存在相当大的重叠，没有清晰的界限（图A）。正常肺组织则形成独立的簇。肿瘤纯度较高的样本分界更明显（图B, C），而HPV阳性的HNSC则聚集在一个独特的亚群中（图D）。

作者选择了2000个变异最大的CpG位点作为机器学习模型的输入特征。基因富集分析显示，这些位点相关的基因主要富集在与组织分化相关的通路中，如“系统发育”和“细胞分化”。

2.3 机器学习模型开发

作者基于这2000个CpG位点，开发并比较了三种不同的机器学习分类器：

人工神经网络 (Artificial Neural Network)：一个包含三个隐藏层（每层64个单元）和0.3dropout率的神经网络。
支持向量机 (Support Vector Machine, SVM)：使用高斯径向基函数（RBF）核。
随机森林 (Random Forest, RF)：包含2000棵决策树。

所有模型都经过了五折交叉验证进行参数调优，并被训练用于区分HNSC、LUSC和正常肺组织三个类别。模型输出每个类别的概率分数，用于表示预测的置信度。

3. 实验分析

3.1 在独立验证队列上的分类性能

将在参考队列上训练好的三个模型应用于包含279个样本的独立验证队列，评估其分类准确性。

图E, F, G (总体准确率)：人工神经网络正确分类了96.4%的病例。支持向量机正确分类了95.7%的病例。随机森林的准确率仅为87.8%。
图B, C, D (置信度阈值分析)：作者发现，通过对模型的概率输出设置一个阈值，可以筛选出置信度更高的预测，从而提高准确率。对于神经网络，当阈值设为0.95时，准确率可提升至99.2%，此时仍有92.1%的样本可被分类（图B, E）。对于SVM，当阈值设为0.85时，准确率可提升至99.2%，此时有90.0%的样本可被分类（图C, F）。对于随机森林，即使将阈值设为0.8，也只有43.0%的样本可被分类（图D, G）。
图H, I, J (模型鲁棒性分析)：作者分析了不同数据来源、样本类型（FFPE vs. 冰冻）、芯片平台和预处理方法对预测分数的影响。结果显示，神经网络（图H）和SVM（图I）的性能不受这些因素的主要影响，表现出良好的鲁棒性。相比之下，随机森林（图J）的性能则受到这些因素的影响，表明其泛化能力较差。

在三个模型中，人工神经网络在保持高覆盖率的同时，实现了最高的准确率和最佳的鲁棒性。

3.2 在独立临床队列中的验证

将训练好的分类器应用于一个由51名患者组成的临床队列，这些患者的最终诊断是基于全面的临床病理信息确定的。

图A (热图)：热图展示了三个分类器对51个临床样本的预测结果，并与临床病理特征进行了对比。人工神经网络的原始准确率达到了98.0%。SVM的准确率为96.1%。随机森林的准确率为84.3%。所有被错误分类的样本都具有较低的概率分数。当应用之前定义的置信度阈值后，所有三个模型的准确率都提高到了100%。
图B (t-SNE分析)：将这51个临床样本与参考队列一起进行t-SNE分析，发现这些样本根据其临床病理诊断，倾向于聚集在预期的参考队列组中（即，被诊断为LUSC的样本聚集在参考LUSC群组中）。

在最接近真实临床场景的队列中，神经网络再次表现出最佳性能，其预测结果与基于金标准（多学科讨论）的诊断高度一致。

3.3 对TCGA数据的重新评估

作者将他们的分类器应用于TCGA LUSC队列中4名同时有HNSC病史的患者。这4名患者在原始研究中被诊断为原发性LUSC。

作者的分类器将其中两名患者的肺部肿瘤以高置信度分类为HNSC转移。这一发现得到了临床随访数据的支持：这两名患者尽管临床分期较低，但总生存期相对较短，这更符合转移性疾病的预后。

此外，其中一个样本被检测出HPV16阳性，而这是整个TCGA LUSC队列中唯一的HPV阳性肿瘤，进一步支持了这是一个来自口咽部的HNSC转移灶的结论。

这些结果表明，作者的方法不仅能够解决诊断难题，还可能纠正现有数据库中潜在的错误诊断。