手术中通过超快速深度学习进行中枢神经系统肿瘤分类.

0. TL; DR

Sturgeon 是一个与患者无关的迁移学习神经网络。利用快速的纳米孔测序（nanopore sequencing）技术，可以在手术过程中获得稀疏的DNA甲基化谱。Sturgeon能够基于这种稀疏的甲基化谱，对中枢神经系统肿瘤进行分子亚型分类。

在对50个样本进行的回顾性测序中，Sturgeon在开始测序后的40分钟内，对其中45个样本给出了准确的诊断（另外5个样本未达到诊断置信度阈值）。作者在25例真实的手术过程中验证了其适用性，实现了低于90分钟的诊断周转时间。其中，18例（72%）诊断正确，其余7例未达到所需的置信度阈值。

1. 背景介绍

中枢神经系统（CNS）肿瘤最常见的首选治疗方法是神经外科手术切除。然而，手术策略在很大程度上取决于肿瘤的类型。例如，对于被认为是无法治愈的、带有特定组蛋白突变（H3K27M）的弥漫性中线胶质瘤，手术的主要目的应是获取组织用于诊断并保留生活质量，而非尝试完全切除。相反，对于其他一些肿瘤类型，如A型后颅窝室管膜瘤，根治性切除则是重要的预后因素。因此，神经外科的策略依赖于对肿瘤的精确和可靠诊断。

全基因组DNA甲基化模式的改变是肿瘤的高度特征性标志，评估DNA甲基化可以揭示肿瘤的起源和预后信息。高维度的CpG甲基化谱可以通过机器学习方法（特别是随机森林分类器）被准确地分配到一个特定的CNS亚型。甲基化芯片结合算法已在常规诊断实践中广泛使用。然而，基于芯片的方法获得甲基化谱的周转时间长达数天，无法满足术中诊断的需求。

目前的术中实践依赖于术前影像学和对冷冻肿瘤切片进行的快速组织学评估。然而，这并非总能得出明确的诊断，有时临时诊断会在术后被修正。这导致一些患者需要进行第二次手术，而另一些患者则在事后看来本可以接受更为保守的手术。

纳米孔DNA测序技术作为一种能够实现超快速测序诊断的方法，近年来崭露头角。它具有设置成本低、设备体积小和数据即时可用等主要优势。此外，纳米孔测序能够直接测量甲基化的胞嘧啶，并大大缩短了样本制备时间。这意味着可以在手术早期将组织样本送去测序，以便及时获得分子诊断来影响和制定神经外科策略。然而，这种应用的一个主要挑战是，在如此短的时间内只能生成非常稀疏的甲基化谱，并且事先无法知道哪些CpG位点会被测序覆盖。

为了在术中环境下实现肿瘤分类，作者开发了Sturgeon，一个与患者无关的神经网络分类器，它经过优化以处理稀疏数据。与需要在手术期间进行患者特异性模型训练的现有分类算法不同，Sturgeon在术前分配了大量的计算资源来训练和验证复杂的神经网络。最终得到的Sturgeon模型是便携式的，在笔记本电脑上运行仅需几秒钟。

2. Sturgeon框架

Sturgeon的核心思想是利用现有的、大规模的甲基化芯片数据，通过模拟生成海量的、逼真的稀疏纳米孔测序数据，来训练一个强大的神经网络分类器。

2.1 纳米孔测序数据模拟

由于缺乏大规模、带有良好注释的纳米孔甲基化数据集，作者开发了一种模拟策略，从公开的甲基化芯片谱（Infinium 450K）生成训练数据。模拟过程包括以下几个关键部分，以确保生成的数据尽可能真实：

通过这种数据增强方法，作者从每个甲基化谱中模拟出数千个独特的浅层纳米孔测序实验，总共生成了3680万个模拟样本用于训练。

2.2 神经网络架构与训练

Sturgeon是一个由三个全连接层组成的神经网络。输入层维度为428,643，对应于450K芯片上的探针数量。两个隐藏层维度分别为256和128，使用Sigmoid激活函数。输出层维度等于待预测的类别数（通用分类器为91类）。

使用AdamW优化器和交叉熵损失函数进行训练。训练中采用了课程学习（curriculum learning）策略，即先用混合了简单和困难样本的数据进行预训练，再用更具挑战性的稀疏数据进行微调。

2.3 四折交叉验证与分数校准

为了评估和构建稳健的模型，作者采用了四折交叉验证的策略。他们将参考数据集分为四份，轮流使用其中两份进行训练，一份用于验证（确定最佳模型状态和进行分数校准），一份用于测试。最终得到四个独立的子模型。

为了让模型的输出分数能够被解释为置信度（例如，0.9的分类器分数对应于90%的正确率），作者使用了温度缩放（temperature scaling）技术对模型输出进行校准。校准后，模型的期望校准误差（ECE）从0.025显著降低到0.002。

在实际预测时，Sturgeon会同时使用这四个子模型进行分类，并以置信度最高的模型的打分作为最终结果。

3. 实验分析

作者在一系列回顾性和前瞻性研究中，对Sturgeon的性能进行了全面评估。

3.1 在模拟数据上的性能

在四折交叉验证的留出测试集上评估Sturgeon的性能。

在模拟约40分钟的测序深度下，Sturgeon在所有类别上的平均F1分数达到了0.935。在家族（family）层面汇总类别后，性能更高，平均F1分数达到0.984。Sturgeon的性能与测序深度直接相关，在模拟测序的前50分钟内性能提升最为显著。

3.2 在儿科队列中的验证

作者获取了94例儿科CNS肿瘤患者的EPIC甲基化芯片数据，并为每个样本模拟了多个不同测序深度的纳米孔测序实验，然后使用Sturgeon进行分类。

3.3 在真实纳米孔测序数据上的性能

回顾性地对27个儿科脑肿瘤样本进行纳米孔测序，并使用Sturgeon进行分类。在一个包含415个CNS肿瘤测序样本的公开数据集上验证Sturgeon的性能。

3.4 术中实时测序应用

在荷兰的两家医院，作者在25台手术过程中实时进行了Sturgeon的完整流程，包括样本处理、DNA提取、测序和分类。

在总共25例手术中，Sturgeon在最多45分钟的测序时间内，正确分类了18例肿瘤（72%）。其余7例分类不明确，原因包括肿瘤类别不在参考数据集中、肿瘤纯度低或病例罕见。

作者展示了几个案例，其中Sturgeon的快速分子分类为外科医生的决策提供了重要的支持信息，例如在INTRA_23和INTRA_25两个病例中，Sturgeon的诊断结果证实了术中冷冻切片诊断的“室管膜瘤”结论，并进一步细化了其分子亚型，为外科医生采取根治性切除策略提供了额外的确定性。

3.5 自适应采样（Adaptive Sampling）

作者测试了纳米孔测序的自适应采样技术，该技术可以优先测序信息丰富的CpG位点，从而提高效率。