HiTAIC：基于层次化分类的泛癌甲基化分析原发癌分类.

• paper：Hierarchical classification-based pan-cancer methylation analysis to classify primary cancer

0. TL; DR

为了利用癌症之间的相似性和甲基化模式的特异性，作者使用层次化分类的思想，开发了癌症层次化分类工具 (Cancer Hierarchy Classification Tool, CHCT)。

CHCT 采用了一种两层架构，将30种癌症的大分类问题，分解为10个更小的、更易于处理的子问题。这种设计不仅利用了不同癌症之间的谱系关系，还提高了模型的准确性和鲁棒性。

在包含1660个样本的测试集中，CHCT 准确地分类了1568例，平均准确率达到94.46%。在一个包含677个癌症样本的独立验证队列中，CHCT 同样显示出很高的诊断潜力，平均准确率达到91.40%。

1. 背景介绍

恶性肿瘤的侵袭性和不可预测的扩散模式，一直对患者和医务人员构成巨大挑战。传统的癌症检测技术通常是侵入性的，且难以在早期阶段检测癌症。随着基因检测技术的发展，分子诊断技术在癌症检测和早期诊断中扮演着越来越重要的角色。

DNA 甲基化是一种基本的表观遗传标记，它调控细胞身份和基因表达，并且在癌变早期就会发生改变。与容易产生假阳性的基因突变检测不同，DNA 甲基化模式通常是组织特异性的，这使得通过检测肿瘤特异性的 DNA 甲基化来开发癌症检测测试成为一种可行的方法。

近年来，已有大量研究利用 DNA 甲基化模式来识别肿瘤。例如，Koelsche 等人构建了用于分类软组织和骨肿瘤的随机森林 (random forest) 模型；Moran 等人建立了能够区分38种肿瘤类型的分类器。这些研究大多采用了扁平化分类 (flat classification)的方法，即试图一次性找到能够区分所有癌症类型的特征。

然而，扁平化分类存在一些固有的局限性：

1. 随着待识别类别数量的增加，分类准确率可能会下降。
2. 无法对分类器范围之外的新癌症类型提供任何预测能力。
3. 某些类别中较差的数据质量可能会影响到所有其他类别的分类性能。

事实上，不同肿瘤之间存在着相似性和起源关系。例如，不同类型的腺癌之间可能比腺癌和鳞癌之间更相似。忽略这种固有的层次关系，可能会丢失重要的信息。

为此，作者考虑了癌症之间的相似性，并开发了一种名为 CHCT (Cancer Hierarchy Classification Tool) 的工具。该工具利用层次化分类 (hierarchical classification) 的思想，将一个大规模的、包含30种癌症类型的分类问题，分解为一系列更小的、更易于处理的分类子问题，旨在通过甲基化谱对原发癌进行更准确、更鲁棒的层次化分类。

2. CHCT方法

CHCT 的整体研究流程如图所示，主要包括五个步骤：数据采集与预处理、样本聚类、生物标志物筛选、模型训练与构建，以及模型验证。

2.1 样本采集与数据预处理

作者从 TCGA 和 GEO 数据库下载了来自30种常见原发癌的8239个组织的甲基化数据（Illumina 450K 芯片）。使用 beta 值来估计甲基化水平。只保留在所有数据集中共享的探针。排除了性染色体上的探针和存在缺失值的探针。

2.2 使用 UPGMA 算法对样本进行聚类

为了客观地划分癌症类别，而不是依赖于传统的临床分类，作者采用了一种无监督的聚类方法。

1. 特征选择：首先，选取了所有样本中变异性最高的1%的 CpG 位点作为聚类的输入特征。
2. 聚类算法：使用 UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean) 算法，基于皮尔逊相关系数 (Pearson correlation coefficient)，对103个癌症亚型进行聚类。
3. 确定聚类数量：使用轮廓系数 (silhouette coefficient) 来评估聚类质量，并确定最佳的聚类数量。
4. 构建层次结构：最终，根据聚类结果，将30种癌症类型分为了12个组，这构成了 CHCT 分类器的第一层。

2.3 使用 ANOVA、Tukey-Kramer 和 Boruta 筛选生物标志物

为了给每个分类器模块筛选出最具信息量的 CpG 位点，作者采用了一个多步骤的特征选择策略。

1. ANOVA 检验：首先，使用方差分析 (Analysis of variance, ANOVA) 来找出在不同癌症组之间存在显著均值差异的探针。
2. Tukey-Kramer 检验：接着，对通过 ANOVA 检验的探针进行两两比较。保留那些能够将某一个癌症组与所有其他组都显著区分开的探针（Tukey校正p值 < 0.01 且平均甲基化差异 $|\Delta\beta| > 0.2$）。
3. Boruta 算法：最后，使用 Boruta 算法进一步筛选特征。Boruta 是一种基于随机森林 (Random Forest) 特征重要性的包装器方法，它通过引入“影子特征”来迭代地筛选出真正具有预测能力的特征。

通过这一系列筛选，作者为 CHCT 的每个分类模块都构建了一个精简而高效的生物标志物集。

2.4 训练随机森林模型并构建 CHCT

作者选择了随机森林 (Random Forest) 算法来构建分类器，因为它具有良好的鲁棒性、处理高维数据的能力和防止过拟合的能力。

CHCT 是一个两层架构的工具。第一层一个随机森林模型，用于将待预测样本分到12个大组中的一个。第二层对于第一层中包含多种癌症类型的组（如 group-2, group-4 等），作者分别为其构建了下一层的随机森林模型，用于进行更精细的亚型分类。

使用训练集（占总样本的80%）和筛选出的生物标志物，对每一层的随机森林模型进行训练。

3. 实验分析

3.1 CHCT 的层次结构概括了癌症类型间的谱系关系

作者首先展示了使用 UPGMA 算法对103个癌症亚型进行无监督聚类的结果。

扇形图清晰地显示，不同的癌症类型根据其甲基化谱的相似性，被自然地聚集在一起，反映了它们之间的谱系或组织关系。例如，肾癌相关的亚型聚在一起；黑色素瘤相关的亚型聚在一起；鳞状细胞癌和腺癌被清晰地分开。

基于聚类结果和轮廓系数，作者最终将30种癌症划分为12个组，这构成了 CHCT 的第一层分类框架。无监督聚类的结果客观地反映了不同癌症在表观遗传层面的内在联系，为构建层次化分类器提供了坚实的基础。

3.2 筛选出的甲基化 CpG 表现出癌症类型特异性

作者通过热图和 UMAP 图展示了筛选出的甲基化标志物的区分能力。

热图显示，为第一层分类器筛选出的8061个 CpG 位点，在12个不同的癌症组中表现出清晰的、具有特异性的甲基化模式。ROC 曲线（AUC=0.999）和 UMAP 聚类图进一步证明，这些筛选出的标志物能够很好地区分不同的癌症组。

3.3 CHCT 能够清晰地分类癌症类型

第一层分类器在1660个测试样本上，准确率达到了98.13%，5折交叉验证得分为0.972。第二层分类器在各个子分类任务中，模型同样表现出色，AUC 最高可达1.000。

最终，CHCT 在测试集上准确预测了1660个样本中的1568个，整体准确率达到了94.5%。CHCT 在内部测试中表现出很高的诊断潜力。

3.4 CHCT 对其他甲基化平台的数据也具有普适性

作者在一个完全独立的、来自 GEO 数据库的包含505个样本的验证队列上测试了 CHCT 的性能。CHCT 表现出了良好的泛化能力，19种癌症类型的平均预测准确率达到了91.48%，其中13种癌症的准确率超过了90%。

尽管来自 TCGA 和 GEO 的同种癌症样本在 UMAP 图上存在一定的批次效应，但 CHCT 仍然能够良好地进行分类。CHCT 能够泛化到在模型训练或探针归一化过程中未遇到的、来自不同数据源和处理方法的数据。

3.5 CHCT 对分类器未覆盖的癌症类型也能提供一定的预测能力

作者使用 CHCT 对两种其分类范围之外的癌症：髓母细胞瘤 (medulloblastoma) 和垂体瘤 (pituitary tumor)进行了预测。

100%的髓母细胞瘤被预测到了包含胶质母细胞瘤 (GBM) 和低级别胶质瘤 (LGG) 的group-6类别中；所有的垂体瘤也同样被归类到了group-6。

由于层次化分类的特性，即使无法对一个新肿瘤进行精确的亚型分类，CHCT 仍有可能将其正确地归入一个相关的上层类别中，这对于临床治疗仍具有重要的指导意义。

综上所述，CHCT 通过其创新的层次化分类策略，成功地将一个大规模、复杂的多分类问题分解，并利用 DNA 甲基化这一稳定的生物标志物，构建了一个在准确性、鲁棒性和泛化能力上均表现出色的癌症分类工具。它不仅在已知的癌症类型上取得了优异的性能，还展示了对未知癌症类型进行初步归类的潜力，为癌症的精准诊断和治疗提供了新的思路和有力的工具。