HiTAIC：利用DNA甲基化谱和分层人工智能分类器追踪原发性和转移性肿瘤的组织起源和肿瘤类型.
0. TL; DR
这项研究采用了一种针对肿瘤类型的分层模型 (hierarchical model)，利用全基因组 DNA 甲基化数据开发了一个多层感知机 (multilayer perceptron, MLP) 模型HiTAIC。
HiTAIC 的核心是一个两层的分层分类模型。第一层将肿瘤分为9个主要类别，第二层再对其中的腺癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤进行更精细的亚型分类。这种分层策略有效地解决了不同癌症亚型之间可能存在的混淆问题。
在追踪原发性癌症起源方面，HiTA-IC 在测试集中的准确率达到了99%，在外部验证数据集中的准确率达到了93%。在识别转移性癌症方面，其在外部数据集上的准确率达到了96%。
1. 背景介绍
癌症是美国的第二大死因。癌症转移是导致癌症死亡的主要原因，约占癌症死亡人数的90%。尽管通过影像学、免疫组化（IHC）等临床手段通常可以识别转移癌的原发灶，但对于那些肿瘤细胞异质性高、形态不典型或缺乏可识别特征的晚期癌症，仍然存在原发灶不明癌 (Cancer of Unknown Primary, CUP)的难题。CUP 约占所有癌症的2-5%，其预后极差，中位生存期不到一年。
由于当今的治疗策略高度依赖于癌症的临床、病理和分子特征，无法确定原发灶的 CUP 给患者的及时和恰当治疗带来了巨大挑战。因此，开发能够辅助识别 CUP 的工具具有重要的临床意义。
DNA 甲基化是一种调控基因表达的表观遗传修饰，它在建立和维持细胞身份方面至关重要。近年来，DNA 甲基化已被广泛用作细胞分型的生物标志物。利用全基因组 DNA 甲基化芯片，结合人工智能 (AI) 技术，为高效追踪肿瘤的组织起源提供了新的机遇。
尽管已有研究展示了基于 DNA 甲基化的机器学习模型在追踪肿瘤组织起源方面的能力，但这些研究存在一些局限性：
- 覆盖的癌症类型有限。
- 缺乏对转移癌的验证。
- 模型大多基于组织部位而非肿瘤类型构建，这可能导致无法区分来自同一组织部位但病理类型不同的肿瘤亚型（如食管鳞癌和食管腺癌）。
- 缺乏易于使用的工具。
为了解决这些问题，作者开发了一种名为 HiTAIC (Hierarchical Tumor Artificial Intelligence Classifier) 的 DNA 甲基化算法。该算法采用了一种针对肿瘤类型的分层模型，并扩大了所覆盖的实体瘤类型，旨在以高分辨率和高准确性追踪原发性和转移性肿瘤的组织起源和亚型。
2. HiTAIC方法
HiTAIC 的整体研究流程如图所示，主要包括数据集构建、分层分类器设计、机器学习模型开发与验证。
2.1 发现数据集与质量控制
作者从 TCGA 和 GEO 数据库收集了来自27种癌症类型的7735个肿瘤样本的 DNA 甲基化芯片数据（450k 和 EPIC 芯片）。
使用 SeSAMe R包进行数据归一化和质控，移除了交叉反应探针、SNP 相关探针、性染色体探针和低质量探针，最终保留了384,640个 CpG 位点。将发现数据集随机按80:20的比例划分为训练集和测试集。
2.2 肿瘤分类器层级与肿瘤类型特异性 CpG 识别
为了解决不同肿瘤亚型之间的混淆问题，作者建立了一个两层的分类器层级。
- 第一层将所有肿瘤分为9个主要类型，如腺癌、鳞状细胞癌、胶质瘤、黑色素瘤等。
- 第二层对第一层中的一些大类进行进一步的细分。
- 层 2A: 包含16种腺癌亚型。
- 层 2B: 包含3种鳞状细胞癌亚型。
- 层 2C: 包含2种黑色素瘤亚型。
为了降低 DNA 甲基化数据的高维度，作者在每个分类层级中，使用 Meffil R包进行了全表观基因组关联研究 (epigenome-wide association study, EWAS)。该方法基于 limma 线性回归，为每个癌症类型识别出前100个超甲基化 (hyper-methylated) 和前100个低甲基化 (hypo-methylated) 的、具有区分性的 CpG 位点。最终，为每个分类层级都建立了一个包含数百到数千个 CpG 位点的特征库。
2.3 机器学习模型开发、验证与应用
作者比较了四种不同的多分类机器学习模型（SVM, RFC, GNB, MLP）的性能，发现多层感知机 (multilayer perceptron, MLP) 在测试集上表现最佳，因此被选为 HiTAIC 的最终模型。
HiTAIC 集成了四个独立的 MLP 模型，每个模型对应分层结构中的一个分类层级。对每个 MLP 模型进行了超参数调优，最终选择了包含一个隐藏层（100个节点）、使用 adam 优化器和0.001学习率的配置。
内部验证在发现数据集上进行了5折交叉验证。外部验证从 GEO 和 ArrayExpress 数据库中收集了1175个样本作为外部验证集。低纯度样本验证在 TCGA 中肿瘤纯度<30%的腺癌样本上进行了测试。转移癌应用在来自8个数据集的175个转移癌样本上进行了测试。cfDNA 应用在来自5个数据集的266个癌症患者的 cfDNA 样本上进行了测试。
2.4 功能通路与基因组上下文富集分析
使用 GREAT (Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool) 对每个分类层级中具有区分性的 CpG 位点进行 GO 生物学通路富集分析。分析这些 CpG 位点是否富集在特定的基因组区域，如 CpG 岛、增强子、启动子等。
3. 实验分析
3.1 模型训练、测试与交叉验证性能
使用 EWAS 筛选出的具有区分性的 CpG 位点，其甲基化热图清晰地显示了不同癌症类型之间独特的甲基化模式。
内部测试集性能:
- 表 2 (第一层): 准确率和加权平均 F1-score 均为98%。
- 表 3 (层 2A - 腺癌): 准确率和加权平均 F1-score 均为98%。
- 表 4 (层 2B - 鳞癌): 准确率和加权平均 F1-score 均为99%。
- 表 5 (层 2C - 黑色素瘤): 准确率和加权平均 F1-score 均为100%。
5折交叉验证的结果与测试集结果高度一致，表明模型性能稳定。
在肿瘤纯度<30%的样本上，HiTAIC 仍能达到97%的准确率。当应用于正常组织时，HiTAIC 能够将其正确地分类到其对应的肿瘤类型中（如正常乳腺被分类为乳腺腺癌）。HiTAIC 在内部测试和交叉验证中均表现出极高的准确性和稳定性，并且对低肿瘤纯度的样本具有鲁棒性。
3.2 外部验证与应用性能
- 表 6 (外部验证): HiTAIC 在包含1175个样本的外部验证集上，总体准确率达到了93%，加权平均 F1-score 也为93%。除了子宫内膜腺癌和卵巢腺癌的 F1-score 稍低外，其他所有癌症类型的 F1-score 均超过80%。值得注意的是，这两种妇科癌症的错分也主要局限在彼此之间。
- 表 7 (转移癌): 在包含175个转移癌样本的数据集上，HiTAIC 表现出色，总体准确率达到了96%，加权平均 F1-score 为98%。
- 表 8 (cfDNA): 在来自癌症患者的 cfDNA 样本上，模型性能较差，准确率仅为15%。作者认为，这是因为 HiTAIC 是基于实体瘤组织数据开发的，并未针对 cfDNA 中混合的血液信号和低丰度的肿瘤 DNA 进行优化。
HiTAIC 在原发性和转移性实体瘤的组织溯源和类型识别方面具有高准确性，但在 cfDNA 上的应用需要专门的优化。
3.3 生物学通路与基因组上下文富集分析
通路富集:
- 图 A (第一层): 富集的通路主要与细胞分化和形态发生有关。
- 图 B (腺癌): 主要富集在肌醇磷酸代谢相关通路。
- 图 C (鳞癌): 主要富集在肺细胞分化相关通路。
- 图 D (黑色素瘤): 主要富集在骨骼系统发育和胚胎形态发生相关通路。
不同层级的 CpG 特征库在基因组区域的富集情况也不同。例如，第一层和层2A的 CpGs 主要富集在开放海域 (open sea)、外显子 (exon) 和增强子 (enhancer) 区域，而层2B的 CpGs 则显著富集在 CpG 岛和启动子区域。
这些差异化的生物学通路和基因组上下文富集结果，为不同肿瘤亚型的发生和发展机制提供了深刻的生物学洞见。
综上所述，HiTAIC 通过其新颖的分层架构和基于 DNA 甲基化的强大生物标志物，为原发性和转移性肿瘤的组织起源和类型追踪提供了一个高精度、高分辨率的计算工具。它的开发和验证为原发灶不明癌 (CUP) 的精准诊断和治疗策略的制定带来了新的希望。
