0. TL; DR

DNC4mC-Deep 整合了六种不同的编码技术（DNC, TNC, BE, NCP, NCPNF, MMI）和一个深度学习模型，用于预测草莓 (F. vesca)、月季 (R. chinensis) 和一个跨物种数据集中的 4mC 位点。

在训练集和独立测试集上，DNC4mC-Deep（即使用 DNC 编码的 CNN 模型）在多个评估指标（MCC, ACC 等）上均显著优于现有的先进模型 i4mC-ROSE。

1. 背景介绍

DNA 甲基化是一种在不改变 DNA 序列的情况下改变遗传表现的化学修饰。它在基因表达调控、基因组印记和细胞发育等多种生物学过程中扮演着重要角色。N4-甲基胞嘧啶 (4mC)、5-甲基胞嘧啶 (5mC) 和 N6-甲基腺嘌呤 (6mA) 是三种常见的 DNA 甲基化类型。

其中，4mC 在原核生物中通过限制-修饰 (R-M) 系统保护宿主 DNA 免受外源病原体 DNA 的降解，并参与调控 DNA 复制及其错误纠正。尽管存在多种实验方法（如质谱法、SMRT 测序等）来检测 4mC 位点，但这些方法在进行全基因组检测时通常耗时且昂贵。因此，开发用于识别 4mC 位点的计算方法变得十分必要。

近年来，已经有一些用于识别不同物种（如 C. elegans, D. melanogaster 等）中 4mC 位点的计算工具被提出。例如，i4mC-ROSE 是首个用于预测蔷薇科（Rosaceae）基因组中 4mC 位点的计算工具，它通过整合多种编码方法和机器学习算法取得了不错的成果。最近，一些基于深度学习的模型，如 4mcDeep-CBI，开始被应用于这一领域，它们通过卷积神经网络和双向长短期记忆网络来自动提取深层特征。

在本文中，作者建立了一个名为 DNC4mC-Deep 的新预测器，旨在识别草莓 (F. vesca)、月季 (R. chinensis) 以及一个新建的跨物种数据集中的 4mC 位点。该模型系统地评估了六种不同的编码技术，并利用一个优化的 CNN 模型进行预测。

2. DNC4mC-Deep 方法

DNC4mC-Deep 的核心是一个基于 CNN 的深度学习模型，作者系统地评估了六种不同的特征编码方法在该模型上的表现。

2.1 基准数据集

作者使用了 Md. Mehedi Hassan et al. 提供的 DNA 4mC 基准数据集，该数据集包含草莓 (F. vesca) 和月季 (R. chinensis) 两个物种的基因组数据。

数据经过严格的质量控制，排除了 ModQV 分数低于20的序列，并使用 CD-HIT-EST 软件移除了序列相似性超过65%的冗余序列。所有序列样本长度均为41 bp，中心为待预测的胞嘧啶 (C)。每个物种的数据集被划分为75%的训练集和25%的独立测试集。

此外，作者还通过合并上述两个物种的数据，并以80%的序列相似性阈值进行去冗余，构建了一个新的跨物种数据集。

2.2 特征编码方法

特征编码在构建预测模型中起着至关重要的作用。作者采用了六种不同的特征编码方法来表示 DNA 序列。

二进制编码 (Binary Encoding, BE)：一种简单有效的编码方式，将 A, C, G, T, N 五种碱基分别编码为5维的二进制向量。
Kmer：一种广泛使用的特征编码算法，通过计算 k-核苷酸（k-mers）的频率来表示序列。
- 二核苷酸组成 (Dinucleotide Composition, DNC)：即 2-mer，计算所有25种（考虑N）二核苷酸的频率。
- 三核苷酸组成 (Trinucleotide Composition, TNC)：即 3-mer，计算所有125种三核苷酸的频率。
核苷酸化学性质 (Nucleotide Chemical Property, NCP)：根据核苷酸的环结构、氢键和官能团三种化学性质，将每个碱基编码为一个3维的二进制向量。例如，’A’ 被编码为 (1, 1, 1)。
核苷酸化学性质与频率 (NCPNF)：将 NCP 编码与每个碱基在序列中的位置频率相结合。
多元互信息 (Multivariate Mutual Information, MMI)：一种提取序列中二元组和三元组核苷酸频率信息的特征编码算法。

2.3 提出的深度学习模型

作者提出了一个基于 CNN 的高效深度学习模型用于 4mC 位点的识别。

2.3.1 模型架构

通过网格搜索 (grid search) 对超参数进行调优后，最终确定的 CNN 模型架构主要包含：

两个并行的卷积块：每个块都包含一个一维卷积层，拥有32个大小为5的滤波器。卷积层使用了 L2 正则化来防止过拟合，并采用 ELU 作为激活函数。
每个卷积层后都跟随一个组归一化 (Group Normalization, GN) 层，将通道分为4组进行归一化。
一个最大池化层 (MaxPooling1D)，池化窗口大小为4，步长为2，用于降低特征维度。
一个 dropout 层，丢弃率为0.25。

两个卷积块的输出被一个扁平化 (flatten) 层展平为一维向量。一个包含32个神经元的全连接（FC）层用于进一步整合特征。最后，一个使用 sigmoid 激活函数的单节点全连接层输出最终的分类概率。

2.3.2 模型训练

模型使用 Keras 框架实现，优化器为随机梯度下降，动量为0.95，学习率为0.005。损失函数为二元交叉熵，批大小为32。训练过程中采用了早停策略，当验证集上的准确率连续30个周期没有提升时，训练将提前终止。

3. 实验分析

作者对六种不同的编码方法在 F. vesca, R. chinensis 和跨物种数据集上的性能进行了系统评估，并与现有的先进模型进行了比较。

3.1 不同特征方法在训练集上的性能评估

作者首先在训练集上通过10折交叉验证评估了六种编码方法的性能。在 F. vesca 数据集上（图2，表4），DNC 编码在 MCC, ACC, Sn 和 Sp 四个指标上均取得了最佳性能，其 MCC 达到了0.829。

在 R. chinensis 数据集上，DNC 编码同样在大多数指标上表现最优，其 MCC 达到了0.828。

在跨物种 (cross-species) 数据集上，DNC 编码再次在除 Sp 外的所有指标上取得最高值，MCC 为0.814。

与现有的先进模型 i4mC-ROSE 相比，使用 DNC 编码的模型在所有指标上都取得了显著的性能提升。例如，在 F. vesca 上，MCC 从0.545提升到了0.829。

ROC 曲线进一步证实了 DNC 和 TNC 编码的优越性，它们在所有三个数据集上的 AUC 值都达到了0.95或0.96。

基于 DNC 编码在训练集上的一致优异表现，作者将使用 DNC 编码的 CNN 模型正式命名为 DNC4mC-Deep。

3.2 在独立测试集上的性能评估

作者在独立的测试集上对 DNC4mC-Deep 的性能进行了评估，并与 i4mC-ROSE 进行了比较。

在 F. vesca 独立测试集上，DNC4mC-Deep 的 MCC 达到了0.635，优于 i4mC-ROSE 的0.601。在 R. chinensis 独立测试集上，DNC4mC-Deep 的 MCC 达到了0.565，同样优于 i4mC-ROSE 的0.535。