NCAE：数据驱动的表示使用深度DNA甲基化网络相干自编码器识别鲁棒的疾病和风险因子信号.

paper：NCAE: data-driven representations using a deep network-coherent DNA methylation autoencoder identify robust disease and risk factor signatures

0. TL; DR

NCAE (Network-Coherent Autoencoders) 是一个利用具有生物学相关性潜在嵌入的网络相干自编码器进行 DNA 甲基化分析的数据驱动特征发现工作流。首先在一个大规模的泛组织人类全表观基因组关联研究 (EWAS) 数据集（包含75,272个样本）上探索了自编码器的架构空间。利用 NCAE 的嵌入训练了可解释的深度神经网络，用于风险因素（衰老、吸烟）和疾病（系统性红斑狼疮）的预测和分类任务。

基于 NCAE 嵌入训练的下游预测模型，在年龄估算、吸烟状态分类和系统性红斑狼疮（SLE）患者分类等任务上，其性能均优于现有的先进方法（如 Horvath 和 Hannum 时钟）。通过对模型进行解释，作者成功识别出了与衰老、吸烟和 SLE 相关的新的 DNA 甲基化特征，并通过通路富集分析验证了它们的生物学相关性。

1. 背景介绍

在系统医学中，知识驱动的数据分析方法利用先验的生物学知识来指导对大数据的分析。其中，网络模型是最常见的方法之一，它将蛋白质或基因等生物实体及其功能关系表示为相互作用网络中的节点和边。然而，这类方法存在一些固有的局限性：

知识不完整与偏见：人类蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络通常是不完整的，并且容易受到研究偏见的影响，因为研究往往集中在已知的蛋白质上。
模型简化：网络推断工具通常会进行简化，这可能影响其预测的确定性。
数据质量限制：不完整或充满噪声的组学数据会导致构建出不准确的网络。

因此，迫切需要一种稳健的、数据驱动的方法，以减少知识偏见并识别新颖且有意义的生物特征。

DNA 甲基化（DNAm）是一种理想的大规模分析模态，因为它分子稳定、呈连续变量性质，并且能够捕捉长期的环境效应。它已被证明在衰老、癌症和其他疾病的研究中非常有用。例如，DNAm 时钟可以根据表观遗传谱准确估算个体的生理年龄；烟草暴露也会在 DNAm 上留下独特的、持久的改变。

深度学习，特别自编码器，为分析复杂的组学数据带来了革命性的变化。AEs 是一种能够通过学习数据的内部表示来高效压缩和重构无标签特征集的神经网络。最近的研究表明，深度 AE 模型的内部嵌入能够自主地捕捉到生物功能模块。

基于此，作者提出了一个新颖的、数据驱动的 DNAm 数据功能分析方法，引入了网络相干自编码器 (network-coherent autoencoders, NCAEs)的概念。NCAEs 是一种深度 AE，其潜在表示具有生物学相关性，能够优先考虑那些在人类相互作用组中共定位区域的基因。通过这种方式，NCAE 能够在一个可解释的潜在空间中捕捉和保留基因间的功能关系。

2. NCAE 方法

作者提出的工作流核心是一个基于 NCAE 的数据驱动特征发现流程，它包括数据预处理、AE 模型的设计与训练，以及基于 NCAE 嵌入的下游监督学习任务。

2.1 数据预处理

作者从 EWAS Data Hub 公共存储库下载了一个包含75,326个人类 DNAm 谱和元数据的多组织数据集。数据经过严格的质量控制流程，包括使用 Gaussian Mixture Quantile Normalization 进行批次校正、过滤无效探针（如 SNP 相关探针、多重命中探针等），并使用 k-近邻 (k-nearest neighbors) 方法填补缺失值。

最终保留了384,629个在 Illumina 450K 和 EPIC 芯片上共有的 CpG 位点。将非癌症样本（n = 50,623）按照64:16:20的比例，通过多变量分层抽样划分为训练集、验证集和测试集。

2.2 自编码器 (AE) 模型的设计与训练

2.2.1 AE 模型架构探索

为了找到最优的 AE 架构，作者训练和评估了24种不同的欠完备自编码器 (undercomplete AE) 架构，包括：

恒定宽度 (constant-width) AE：包含一到四层隐藏层，每层隐藏节点的数量从32到1024不等。
沙漏型 (hourglass-shaped) AE：三层隐藏层，最窄的瓶颈层包含2或16个节点。

通过超参数搜索，作者确定了最优的训练配置：Adam 优化器，学习率为 $9.0 \times 10^{-5}$，隐藏层激活函数为 leaky ReLU，输出层为 sigmoid。为防止过拟合，训练采用早停 (early stopping) 策略。

2.2.2 从隐藏节点进行的光照分析 (Light-up analysis)

为了探究 AE 隐藏层与输入 CpG 之间的关联，作者采用了一种名为光照分析 (light-up analysis)的扰动前向传播技术。

对于一个给定的隐藏层 $k$ 中的一个隐藏节点 $h$，作者构建一个激活向量 $x_a$，其中节点 $h$ 的激活值设为最大值（1），其余节点设为最小值。然后，将这个激活向量向前传播，直到输出层。

\[x^k = \begin{cases} f^k(W^k x^{(k-1)} + b^k) & \text{if } p < k \le L \\ x_a & \text{if } p = k \end{cases}\]

其中，$f^k, W^k, b^k$ 分别是第 $k$ 层的激活函数、权重矩阵和偏置项。

输出层的激活信号 $x^L$ 与模型的输入具有相同的维度，其值的变化可以用来衡量每个输入 CpG 位点与被“点亮”的那个隐藏节点 $h$ 的关联强度。通过对每个隐藏节点和每个隐藏层重复此过程，可以量化整个网络中特征的层次化表示。

2.2.3 从输入进行的光照分析

为了在下游的监督学习任务中确定每个 CpG 对预测结果的贡献，作者采用了另一种基于扰动的光照分析。

首先，递归地将每个输入的 CpG 值分别设置为完全高甲基化（$\beta = 1$）或完全低甲基化（$\beta = 0$），然后将这些扰动后的样本通过训练好的 NCAE 和下游的 DNN 模型进行前向传播。

通过比较扰动后的模型输出（如预测的年龄或疾病分类概率）与使用平均甲基化谱作为输入时的输出之间的差异，来衡量每个 CpG 对预测目标的贡献度。

2.3 基于 NCAE 嵌入的监督学习模型

在确定了最优的 NCAE 架构后，作者利用其来执行具体的下游预测任务。

使用训练好的 NCAE 将高维的 DNAm 样本压缩成128维的低维潜在嵌入。将这些嵌入作为输入，训练一个前馈全连接深度神经网络 (feed-forward, fully connected DNN) 来执行具体的回归或分类任务。通过网格搜索 (grid searches) 来探索 DNN 的最优深度、宽度和正则化选项。

3. 实验分析

作者通过一系列详尽的实验，不仅确定了最优的 NCAE 架构，还展示了其在多个实际应用中的卓越性能。

3.1 深度 AEs 能够准确地重构甲基化数据

作者首先评估了不同 AE 架构的重构性能。

全局性能：恒定宽度模型的全局重构 $R^2$ 值在0.978到0.993之间。性能的提升主要与模型宽度的增加有关，而与深度的关系不大。
局部性能：在 CpG 位点层面，宽度为128个节点的模型已经能够解释85.9%的方差，实现了约3000倍的降维。相比之下，瓶颈层过窄的沙漏型模型（如2个节点）重构性能较差。
可预测性分析：作者发现，那些方差较大、高甲基化比例较高的 CpG 位点更容易被准确重构。

3.2 深度 AE 第三层的 CpG 与高度共定位的基因相关

作者假设，一个功能上有意义的表示应该能将功能相关的基因（即在 PPI 网络中距离较近的基因）的 CpG 位点聚集在一起。

通过光照分析和在 STRING PPI 网络中的共定位分析，作者发现与 AE 隐藏节点关联度最高的基因表现出比随机预期更高的共定位程度（即更低的谐波平均距离, HAD）。这种共定位效应随着网络深度的增加而增强，在第三层达到顶峰，而在第四层减弱。这种模式在宽度为128、256和512个节点的架构中最为显著。

最终，作者确定三层隐藏层、每层128个节点的 AE 架构在共定位和中心性方面表现最佳，并将其定义为 NCAE。

3.3 NCAE-Age 模型准确估算生理年龄

图 A, B: 作者使用 NCAE 嵌入训练了一个名为 NCAE-Age 的 DNN 模型来预测年龄。在测试集上，NCAE-Age 的性能（$R^2 = 0.965$）优于经典的 Horvath ($R^2 = 0.936$) 和 Hannum ($R^2 = 0.929$) 甲基化时钟。
图 C: 在不同的年龄分段中，NCAE-Age 的估计也比其他两个时钟更准确。
图 D: 通过光照分析识别出的与年龄预测最相关的 CpG 特征，其关联的基因显著富集于已知的 DNAm 时钟基因，以及 PI3K-Akt, MAPK, AMPK 等已知的衰老相关通路。

3.4 NCAE-Smoke 模型确定吸烟状态

作者训练了一个名为 NCAE-Smoke 的模型来分类“当前吸烟者”、“既往吸烟者”和“从不吸烟者”。与另一个名为 EpiSmokEr 的预测器相比，NCAE-Smoke 在平均敏感性（65% vs 60%）和可比的特异性（均为79%）上表现更优或相当。

NCAE-Smoke 识别出的吸烟相关 DNAm 特征，与10个已发表的吸烟特征集中的8个存在显著重叠。通路富集分析显示，这些特征富集于癌症、p53 信号通路和 DNA 损伤反应等与吸烟危害密切相关的通路中。

3.5 NCAE-SLE 模型用于组织特异性疾病生物标志物发现

图 A: 作者在一个包含多种组织和细胞类型的系统性红斑狼疮 (SLE) 数据集上，训练了一个 NCAE-SLE 分类器。其性能在多组织和多数单组织数据集上均显著优于一个基于 PCA 的 DNN 模型。
图 B: 通过光照分析，作者在每个组织中都识别出了与 SLE 预测相关的 CpG 特征。这些特征关联的基因在所有组织中都显著富集于已知的 SLE 相关基因。
图 C, D: 对这些组织特异性和多组织共享的特征进行通路富集分析，发现了与 SLE 病理机制相关的通路，如爱泼斯坦-巴尔病毒 (Epstein–Barr virus) 感染、Th17细胞分化、T细胞介导的免疫等。

这些实验结果充分证明，NCAE 及其衍生的监督学习模型不仅性能卓越，而且其数据驱动的发现能力能够揭示与复杂疾病和风险因素相关的、具有生物学意义的新型表观遗传特征。