iPromoter-5mC：一种用于识别全基因组DNA启动子中5-甲基胞嘧啶位点的融合决策预测器.
0. TL; DR
基于癌症细胞系百科全书 (CCLE) 数据库中小细胞肺癌 (SCLC) 的启动子甲基化数据，本文构建了一个名为 iPromoter-5mC 的融合决策预测器，它利用深度神经网络来识别启动子中的甲基化修饰位点。
该方法使用独热编码 (One-Hot Encoding) 对启动子样本进行编码，通过对不平衡的负样本进行下采样，构建了11个子模型，并通过简单的多数投票策略进行融合决策，有效提升了预测的稳定性和准确性。
在独立测试集上，iPromoter-5mC 取得了高达90.22%的准确率和0.5771的马修斯相关系数 (MCC)，显著优于现有的 iDNA-Methyl 预测器。
1. 背景介绍
DNA 甲基化在调节基因表达、细胞分化、发育过程和癌症发展等多种细胞过程中扮演着至关重要的角色。目前，研究最广泛的三种 DNA 甲基化类型是 N6-甲基腺嘌呤 (6mA)、N4-甲基胞嘧啶 (4mC) 和 5-甲基胞嘧啶 (5mC)。其中，5mC 在体细胞中几乎只发生在 CpG 位点上。
最近的研究表明，启动子区域 CpG 岛的异常 5mC 水平与多种肿瘤抑制基因 (TSGs) 的失活有关。在年轻的正常细胞中，启动子区域的 5mC 水平较低；而在衰老和癌症中，特定基因组位点（尤其是 TSGs 启动子区域的 CpG 岛）会获得 5mC，导致基因沉默和功能丧失。这种异常的启动子甲基化可以作为癌症诊断和预后判断的潜在生物标志物。
小细胞肺癌 (SCLC) 是一种恶性程度极高的肺癌，其甲基化模式与其他肺癌显著不同，特别是在离散启动子的 CpG 岛上存在密集的高甲基化簇。因此，本研究聚焦于 SCLC，旨在提高评估其启动子甲基化状态的能力。
尽管甲基化DNA免疫沉淀测序 (MeDIP-seq)、亚硫酸氢盐测序 (MB-seq) 等湿实验方法可以检测 5mC 位点，但它们成本高昂且耗时。因此，开发准确的计算方法来检测 DNA 5mC 修饰位点变得尤为迫切。
在过去十年中，已经有一些计算方法被提出来用于识别 5mC 位点，例如基于 SVM 的 Methylator、MethCGI 和 iDNA-Methyl，以及基于深度学习的 NanoMod 和 DeepCpG。然而，这些方法仍然存在一些不足：
- 样本量小：与日益增长的海量高通量数据相比，以往研究的样本规模较小。
- 可用性差：许多方法没有提供可用的网络服务器，给研究者带来不便。
- 缺乏特异性：目前还没有专门用于识别特定癌症启动子区域 5mC 位点的计算工具。
为了解决这些问题，作者开发了 iPromoter-5mC，一个旨在快速、精确地识别 SCLC 启动子中 DNA 5mC 修饰位点的工具。
2. iPromoter-5mC 方法详解
iPromoter-5mC 的核心是一个基于深度神经网络的融合决策预测器。其构建过程包括基准数据集的构建、特征提取和集成预测器框架的设计。
2.1 基准数据集的构建
高质量的数据集是构建分类模型的基石。作者从癌症细胞系百科全书 (CCLE) 数据库中收集了小细胞肺癌 (SCLC) 的基因启动子区域位置信息和由简化代表性亚硫酸氢盐测序 (RRBS) 实验得到的 5mC 修饰位点信息。
根据 5mC 修饰位点在启动子中的位置，作者从人类基因组参考序列 GRCh37/hg19 中提取了样本序列。每个样本序列的长度为 $2\delta + 1$ bp，中心为待预测的胞嘧啶 (C)。
\[E_\delta(C) = E_{-\delta}E_{-(\delta-1)}...E_{-1}CE_{+1}...E_{+(\delta-1)}E_{+\delta}\]如果一个胞嘧啶的甲基化水平大于零，则该序列样本被定义为阳性样本 (positive sample)；否则，定义为阴性样本 (negative sample)。为了更客观地反映 5mC 在启动子中的真实分布，作者在本研究中将阳性样本与阴性样本的比例设置为约1:11。
使用 CD-HIT 软件移除了序列相似性超过80%的序列，以减少冗余和同源性偏见。最终获得了包含893,326个序列样本的基准数据集。作者随机选取其中80%作为训练集，剩余20%作为独立的测试集。
2.2 从DNA序列中提取特征
作者采用了两种有效的特征提取方法来编码 DNA 序列样本。
2.2.1 独热编码 (One-Hot Encoding)
独热编码是一种简单而有效的特征提取方法，尤其适用于深度学习模型。它将四个核苷酸 A, C, G, T 分别表示为四个独立的四维独热向量：$[1,0,0,0], [0,1,0,0], [0,0,1,0], [0,0,0,1]$。
2.2.2 脱氧核苷酸性质与频率 (DPF)
DPF 是一种有效的序列编码方案，它考虑了脱氧核苷酸的化学性质。
每个脱氧核苷酸被转换成一个三维向量 $(x_k, y_k, z_k)$，分别代表其环结构 (ring structure)（嘌呤/嘧啶）、官能团 (functional group)（氨基/酮基）和氢键强度 (hydrogen bond)。
\[x_k = \begin{cases} 1 & \text{if } Q_k \in \{A, G\} \\ 0 & \text{if } Q_k \in \{C, T\} \end{cases}, \\ y_k = \begin{cases} 1 & \text{if } Q_k \in \{A, C\} \\ 0 & \text{if } Q_k \in \{G, T\} \end{cases}, \\ z_k = \begin{cases} 1 & \text{if } Q_k \in \{A, T\} \\ 0 & \text{if } Q_k \in \{C, G\} \end{cases}\]为了提取位置信息，作者还计算了脱氧核苷酸的累积频率 $\lambda_k$：
\[\lambda_k = \frac{\sum_{j=1}^{k} F(M_j)}{k}\]其中，$F(M_j)$ 是一个指示函数，当第 $j$ 个碱基与当前碱基 $Q_k$ 相同时为1，否则为0。
将化学性质和累积频率结合，每个碱基被表示为一个四维向量 $(x_k, y_k, z_k, \lambda_k)$。
2.3 集成预测器框架
由于训练集中阳性样本和阴性样本存在严重的不平衡（约1:11），作者采用了下采样的方法来构建一个集成预测器。
将训练集中的阴性样本随机划分为11个大小相等的组。 将每个阴性样本组与训练集中的所有阳性样本结合，形成一个平衡的训练子集。在每个子集上，训练一个独立的深度神经网络子模型。这样，总共可以得到11个子模型。
对于一个待查询的序列，首先将其输入到11个子模型中，得到11个预测结果。然后，通过简单多数投票策略对这11个结果进行集成，得到最终的分类决策。作者采用了严格的判别标准：只有当所有11个子模型都认为一个位点是真 5mC 位点时，iPromoter-5mC 才会做出阳性预测。
每个 DNN 子模型的架构为一个包含5个全连接层（神经元数量分别为64, 128, 256, 128, 64）的网络，激活函数为 ReLU。最后一层包含两个神经元，并使用 sigmoid 作为激活函数。为了防止过拟合，在最后一个全连接层前加入了一个 dropout 层。
3. 实验分析
作者通过一系列实验，对 iPromoter-5mC 的性能进行了评估和分析。
3.1 窗口大小分析
作者首先分析了不同窗口大小（即序列长度）对模型性能的影响。通过在 δ 从10到20的范围内进行搜索，作者发现，当 $\delta = 20$（即序列长度为41 bp）时，三种不同的特征编码方法（One-hot, DPF, One-hot-DPF）都取得了最佳的预测效果。通过比较 Acc 和 MCC 值，发现独热编码 (One-hot) 是最优的特征提取方法。因此，后续的分析都基于41 bp的序列长度和独热编码。
3.2 DNN 模型的性能
在训练数据集上进行五折交叉验证，iPromoter-5mC 模型取得了优异的性能，其敏感性 (Sn) 为87.46%，特异性 (Sp) 为90.39%，准确率 (Acc) 为90.16%，MCC 为0.5743。
在训练集上绘制的 ROC 曲线显示，模型的 AUC 值高达0.9566，表明 iPromoter-5mC 具有出色的性能和稳定性。
作者比较了三种不同特征提取方法（One-hot, DPF, One-hot-DPF 组合）下 DNN 模型的性能。结果显示，三种方法得到的各项指标值差异很小，这表明 DNN 算法模型对于识别 5mC 修饰位点具有优越的稳定性。
3.3 鲁棒性和可靠性分析
为了检验模型的泛化能力，作者在独立的测试数据集上对 iPromoter-5mC 进行了测试。11个子模型在独立测试集上的表现非常稳定，其 Sn, Sp, Acc, MCC 和 AUC 值分别稳定在95%, 83%, 85%, 0.52和0.95左右。这表明构建的子模型对于新数据具有很强的鲁棒性。
经过多数投票集成后，最终的 iPromoter-5mC 模型在独立测试集上的性能得到了提升，其 Sn, Sp, Acc, MCC 和 AUC 分别为87.77%, 90.42%, 90.22%, 0.5771和0.9570。Acc 和 MCC 指标的提升尤其明显，证明了所设计的融合决策框架是合理且高效的。
为了进一步验证框架的鲁棒性，作者在包含训练集和测试集的整个基准数据集上进行了五折交叉验证。ROC 曲线显示，即使在训练数据扩大后，预测框架的性能依然可靠和稳定。
作者还在人类肝癌细胞系（HUH7_LIVER）的数据上测试了该方法。结果显示，模型在该数据集上也取得了好的性能（训练集 AUC=0.9736，独立测试集 AUC=0.9735），表明该方法可以被应用于其他癌症细胞系中 5mC 位点的预测。
3.4 与现有预测器的比较
作者将 iPromoter-5mC 与另一个可用的在线预测器 iDNA-Methyl 进行了比较。
在 iPromoter-5mC 的独立测试集上，iPromoter-5mC 的 Acc (90.22%) 和 MCC (0.5771) 显著高于 iDNA-Methyl (85.90% 和 0.1730)。
作者分析了性能差异的原因，主要包括：(1) 功能不同：iDNA-Methyl 是全基因组范围的，而 iPromoter-5mC 专注于启动子区域；(2) 数据集规模和不平衡度不同：iPromoter-5mC 的训练数据量远大于 iDNA-Methyl，并且其正负样本比例更不平衡（1:11 vs 1:2）。
为了进一步公平比较，作者使用 iPromoter-5mC 在 iDNA-Methyl 的样本数据上进行了预测。结果显示，iPromoter-5mC 的性能仍然优于 iDNA-Methyl，这得益于其在大数据量上的训练。
这些结果表明，深度学习模型在处理大规模数据集时，相比传统的机器学习方法（如 SVM）更具优势。iPromoter-5mC 可以作为 iDNA-Methyl 之后的一个出色的补充工具。
