DISMIR：通过整合个体cfDNA读段的DNA序列和甲基化信息进行基于深度学习的非侵入性癌症检测.

paper：DISMIR: Deep learning-based noninvasive cancer detection by integrating DNA sequence and methylation information of individual cell-free DNA reads

0. TL; DR

DISMIR 通过整合血浆 cfDNA 全基因组亚硫酸氢盐测序 (WGBS) 数据中的 DNA 序列和甲基化信息实现了超灵敏和稳健的癌症检测。DISMIR 引入了一个名为转换区域 (switching region)的新特征来定义癌症特异性的差异甲基化区域，从而在读段（read）分辨率上富集了与癌症相关的信号。

在利用低深度血浆 cfDNA WGBS 数据进行肝细胞癌（HCC）检测时，DISMIR 展现了极高的准确性和鲁棒性，即使在超低测序深度下依然表现出色。分析表明，DISMIR 对单个 CpG 位点甲基化状态的改变不敏感，这意味着它能有效抵抗 WGBS 实验中的技术噪音。

1. 背景介绍

细胞游离DNA (cfDNA) 是主要由凋亡或坏死细胞释放到体液（如血浆）中的降解 DNA 片段。在癌症早期，即使患者没有明显的临床症状，癌细胞的 DNA 状态已经发生改变，这些改变可以作为循环肿瘤DNA (ctDNA) 在癌症患者的血浆中被检测到。随着高通量测序技术的发展，通过识别 cfDNA 中的癌症信号来进行液体活检正成为一种新颖的癌症诊断方法。

目前大多数 cfDNA 研究关注的是癌基因的突变。然而，由于早期癌症中 ctDNA 的比例极低，以及驱动癌症发生的突变具有高度异质性，仅靠突变检测面临巨大挑战。其他一些研究尝试利用染色体重排、拷贝数变异或片段化模式等特征，但这些低分辨率的信号在早期癌症检测中很容易被噪音淹没。

DNA 甲基化状态在癌症早期会在全基因组范围内发生广泛改变，使其成为一个信息量丰富的早期癌症检测特征。近年来，一些概率方法如 CancerLocator 和 CancerDetector 在预测癌症来源和肿瘤负荷方面取得了可喜的成果。特别是 CancerDetector，它在单个测序读段（read）的分辨率上预测 cfDNA 的来源，提供了一种全新的视角。然而，这些方法可能受到测序深度的系统性影响，从而降低诊断的准确性。

已有研究表明，DNA 的甲基化状态部分受到其周围序列的顺式调控。因此，周围的 DNA 序列可能为分析甲基化状态和预测单个读段的来源提供宝贵信息。基于此，作者开发了一种名为 DISMIR 的深度学习模型，它能够同时整合选定差异甲基化区域（DMRs）中单个读段的 DNA 序列和甲基化信息，从而在极低的测序深度下也能实现高精度的预测。

2. DISMIR 方法

DISMIR 的最终目标是通过整合血浆 cfDNA WGBS 数据中的 DNA 序列和甲基化信息来诊断癌症。整个流程包括四个主要步骤：

A 识别肝细胞癌（HCC）特异性差异甲基化区域（DMRs）

为了富集与癌症相关的信号，作者提出了一种名为转换区域 (switching regions)和转换读段 (switching reads)的新特征来定义 DMRs。其核心思想是，在这些区域中，癌组织的读段甲基化模式与健康人血浆的读段甲基化模式有清晰的界限。

具体步骤如下（以低甲基化转换区域为例）：

将全基因组划分为不重叠的500-bp区域。
对于每个区域，计算来自癌组织样本和健康血浆样本的所有读段（至少包含3个 CpG 位点）的甲基化率分布。
定义健康血浆读段分布的最小值为 $H_{min}$，癌组织读段分布的最小值为 $T_{min}$。
如果 $H_{min} - T_{min}$ 大于一个设定的阈值（本研究中为0.3），则该区域被定义为一个低甲基化转换区域。
所有位于该转换区域且甲基化率低于 $H_{min}$ 的读段，都被定义为转换读段。

这种方法能够有效筛选出那些在读段级别上具有明显区分度的区域，从而为后续的深度学习模型提供高质量的输入。

B&C 读段来源预测的深度学习模型

作者构建了一个深度学习模型来预测每个读段来源于癌组织的概率，这个概率值被称为 d-score。

输入编码

对于每个从转换区域筛选出的读段，作者进行了如下编码处理：

将读段修剪成统一的长度（本研究中为 $L=66$）。
对于读段中的每个碱基，使用 one-hot 编码表示其核苷酸类型（A, C, G, T）。
同时，编码该碱基的甲基化状态（1: 甲基化, 0: 未甲基化）。
最终，每个读段被编码成一个 $L \times 5$ 的矩阵，同时包含了序列和甲基化信息。

模型架构

模型的核心架构参考了 DanQ 模型并进行了调整，主要包括：一个一维卷积层、一个最大池化层、一个双向LSTM、一个一维卷积层、一个扁平化层、三个全连接层。

模型的输出是一个介于0和1之间的连续值，即 d-score。d-score 越接近1，表示该读段越有可能来源于癌组织。

D 估算肿瘤来源的cfDNA比例

在获得每个读段的 d-score后，作者采用最大后验概率 (maximum posterior probability) 的方法来估算一个血浆样本中肿瘤来源读段的比例 $r$。

假设一个样本有 $n$ 个读段，其 d-scores 分别为 $d_1, d_2, …, d_n$。给定肿瘤比例为 $r$，该样本的后验概率 $P$ 可以表示为：

\[P = \prod_{i=1}^{n} [r \times d_i + (1 - r) \times (1 - d_i)]\]

通过找到使 $P$ 最大化的 $r$ 值，即可得到该样本的肿瘤比例估计值 $\hat{r}$：

\[\hat{r} = \arg\max_{r \in [0,1]} \prod_{i=1}^{n} [r \times d_i + (1 - r) \times (1 - d_i)]\]

这个 $\hat{r}$ 值可以作为诊断癌症的风险评分。作者通过从0到1以0.001为步长进行网格搜索来找到最优的 $\hat{r}$。

3. 实验分析

作者使用公开的肝细胞癌（HCC）患者和健康人的血浆 cfDNA WGBS 数据，对 DISMIR 的性能进行了全面评估。

3.1 DISMIR在早期HCC检测中表现出高精度

图 A: 作者将 DISMIR 与 CancerDetector、FSR（仅使用转换读段比例）以及传统的机器学习方法（SVM, 随机森林）进行了比较。结果显示，DISMIR 在区分 HCC 患者和健康人方面表现最佳，其 AUC (ROC曲线下面积) 达到了 $0.9969 \pm 0.0016$。在100%特异性下，灵敏度为 $93.94 \pm 3.15\%$。这证明了 DISMIR 的高精度。此外，仅使用转换区域（deepCDR）但没有转换读段概念的模型，其性能劣于完整的 DISMIR，这凸显了转换区域定义的优势。
图 B: 随着测序深度的降低，CancerDetector 的准确性显著下降，而 DISMIR 依然保持了很高的精度。当数据被亚采样到仅为原始的1%时（覆盖度从 0.01× 到 0.1×），DISMIR 的 AUC 仍高达 $0.9112 \pm 0.0307$，显著优于 CancerDetector ($0.7432 \pm 0.0463$)。这证明了 DISMIR 的超高灵敏度。
图 C: 作者通过模拟不同肿瘤比例和测序深度的混合数据，进一步验证了模型的鲁棒性。结果显示，CancerDetector 的预测值会随着测序深度的增加而显著增加，这可能给临床诊断带来偏差。相比之下，DISMIR 的预测值在不同测序深度下都保持一致，表现出高度的鲁棒性。

3.2 DISMIR的卷积核关注DNA序列和甲基化的联合模式

为了探究深度学习模型的可解释性，作者对第一层卷积核进行了可视化。

图 A: 通过将激活值最高的输入序列叠加，作者发现一些卷积核学习到的模式与已知的 HCC 相关转录因子基序（motifs）高度匹配，例如 EGR2 和 ZFP64。更有趣的是，在可视化中将甲基化的胞嘧啶（’M’）与未甲基化的（’C’）区分开后，发现模型不仅学习了序列模式，还学习了特定位置的甲基化状态。例如，在 ZFP64 样的卷积核中，CpG 位点上的胞嘧啶几乎总是甲基化的。
图 B: 不同的卷积核关注不同位置 CpG 位点的不同甲基化状态。例如，kernel #54 和 #91 都关注第8个位置的 CpG，但对甲基化状态的偏好完全相反。

这表明，DISMIR 成功地将 DNA 序列和甲基化信息结合起来，作为初步的模式提取，从而更准确地预测读段的来源。

3.3 DISMIR利用DNA序列和甲基化的联合模式来区分HCC来源的读段

为了验证模型不仅仅是依赖于简单的甲基化率，作者进行了一系列实验。

图 A: 读段的甲基化率与其 d-score 呈现显著的负相关（Pearson’s $r = -0.900$），但对于相似甲基化率的读段，其 d-score 变化巨大，说明 d-score 的决定因素远不止甲基化率。
图 B: 作者比较了原始读段与其反向互补（reverse complementary, RC）读段的 d-score。尽管两者具有完全相同的甲基化率，但它们的 d-score 存在差异，同时又高度相关（Pearson’s $r = 0.869$）。这表明 DNA 序列的方向性信息也被模型利用了。
图 D: 在一个选定的转换区域内，改变不同 CpG 位点的甲基化状态对 d-score 的影响（$\Delta_{single}d\text{-score}$）是不同的，这无法用甲基化率的改变来完全解释。
图 E, F: 作者比较了单个位点改变引起的 d-score 变化之和（$\Delta_{sum}d\text{-score}$）与所有位点同时改变引起的 d-score 变化（$\Delta_{all}d\text{-score}$）。结果发现，$\Delta_{all}d\text{-score}$ 几乎总是大于 $\Delta_{sum}d\text{-score}$。这表明 DISMIR 更多地关注全局的甲基化改变，而不仅仅是单个 CpG 位点影响的简单叠加。

3.4 DISMIR的基序相关卷积核能够抵抗单个CpG位点甲基化状态的改变

图 A, B: 通过比较 $\Delta_{all}d\text{-score}$ 和 $\Delta_{sum}d\text{-score}$ 的分布，作者发现，对于某些特定卷积核激活的读段，其 $\Delta_{all}d\text{-score}$ 的分布与所有读段的分布有显著差异，而 $\Delta_{sum}d\text{-score}$ 的差异则较小。
图 C: 作者进一步量化了这种差异，发现那些与已知基序相关的卷积核（蓝色点）更倾向于落在第四象限。这意味着这些功能性卷积核激活的读段，对全局甲基化状态的改变（$\Delta_{all}d\text{-score}$）非常敏感，而对单个位点甲基化状态的改变（$\Delta_{sum}d\text{-score}$）则相对不敏感。

这一发现非常重要，因为它解释了 DISMIR 鲁棒性的来源：模型学会了忽略通常由技术噪音引起的单个位点的甲基化改变，而关注更能代表生物学状态（如癌症）的全局甲基化模式改变。这使得 DISMIR 成为一种高度稳健的癌症检测方法。