cfDNA片段组学谱的表观遗传分析.

• paper：Epigenetic analysis of cell-free DNA by fragmentomic profiling

0. TL; DR

FRAGMA (FRAGmentomics-based Methylation Analysis) 通过分析围绕 CpG 位点（一个11个核苷酸的窗口内）的 cfDNA 切割谱来推断 cfDNA 甲基化。文章首次证明了可以仅通过分析 cfDNA 的片段化模式来推断其甲基化状态，利用 cfDNA 的切割模式；进一步开发了一个深度学习算法，实现了在单个 CpG 分辨率上推断甲基化状态，AUC 达到了0.93。

1. 背景介绍

细胞游离DNA (cfDNA) 的片段化模式包含了与其组织来源相关的丰富分子信息。例如，与主要来自造血系统的背景 DNA 相比，孕妇血浆中的胎儿 DNA 和癌症患者血浆中的肿瘤 DNA，其片段长度通常更短。

近年来，一系列被称为片段组学 (fragmentomics)的标记被发现，如核小体足迹 (nucleosome footprints)、片段末端基序 (fragment end motifs) 和锯齿状末端 (jagged ends) 等，它们为无创诊断提供了新的维度。已有研究表明，cfDNA 的片段化模式可以反映基因的表达状态，并且与 DNA 核酸酶（如 DNASE1L3）的活性密切相关。

然而，cfDNA 的片段化模式如何与 DNA 甲基化相互作用，以及是否可以利用片段组学特征来推断 cfDNA 的甲基化状态，在很大程度上仍是未知的。

目前，评估 DNA 甲基化的金标准是亚硫酸氢盐测序 (bisulfite sequencing)。但这种方法的关键局限在于，亚硫酸氢盐处理会严重降解 DNA，这在分析稀有目标分子（如早期癌症的肿瘤 cfDNA）时，会极大地增加取样变异。

因此，作者探索了一种全新的可能性：能否直接利用从标准二代测序 (NGS) 中获得的 cfDNA 片段组学特征，来评估 DNA 甲基化，从而完全避免化学或酶促转化？ 如果成功，这种方法将能够利用 NGS 的高通量，同时避免 DNA 降解，并可能轻松地集成到现有的 cfDNA 分析平台中。

在这项研究中，作者利用 CpG 位点附近的片段化模式来推断其甲基化状态。作者将这种方法称为 FRAGMA (FRAGmentomics-based Methylation Analysis)。

2. FRAGMA 方法

FRAGMA 的核心是分析围绕一个 CpG 位点的特定窗口内，cfDNA 片段末端的分布频率，即切割谱 (cleavage profile)。

2.1 切割谱与 CGN/NCG 基序比

切割谱 (Cleavage Profile)

在一个以目标 CpG 位点为中心的11个核苷酸（nt）的切割测量窗口 (cleavage measurement window)内，计算每个核苷酸位置上 cfDNA 片段末端（5’端）出现的频率。这个频率被定义为切割比例 (cleavage proportion)。一个窗口内所有位置的切割比例构成了该 CpG 位点的切割谱。

CGN/NCG 基序比 (Motif Ratio)

作者发现，切割谱与 CpG 的甲基化状态相关。甲基化的 CpG 往往在胞嘧啶本身（位置0）有更高的切割概率，而在其上游一个碱基（位置-1）有更低的切割概率。这种差异性切割导致了不同末端基序的相对丰度变化。

• 甲基化位点在位置0的高切割，富集了以 CGN（N代表A/C/G/T）开头的5’末端基序。
• 甲基化位点在位置-1的低切割，减少了以 NCG 开头的5’末端基序。

作者假设，一个基因组区域的 CGN/NCG 基序比可以反映该区域的整体甲基化水平。

2.2 基于深度学习的单 CpG 分辨率甲基化预测

为了实现对单个 CpG 位点甲基化状态的精确预测，作者进一步开发了一个卷积神经网络 (CNN) 模型。

对于一个待分析的 CpG 位点，构建一个包含其上游5个核苷酸和下游5个核苷酸的切割测量窗口。对于窗口中的每一个位置，根据该位置的核苷酸种类，将该位置的切割比例填入一个二维矩阵的相应单元格中。例如，如果位置-1是鸟嘌呤(G)，其切割比例是1.40，则在矩阵的-1列、G行填入1.40，该列的其他行（A, C, T）填0。分别为 DNA 的 Watson 链和 Crick 链构建这样的矩阵，然后将它们合并成一个最终的输入矩阵。将构建好的矩阵输入到一个 CNN 模型中进行训练和预测，最终输出一个概率分数，表示该 CpG 位点为超甲基化的可能性。

3. 实验分析

3.1 DNA 甲基化直接影响 cfDNA 的切割谱

作者首先在健康对照者的血浆 DNA 中，比较了超甲基化和低甲基化 CpG 位点周围的切割谱。

• 图 A: 基于亚硫酸氢盐测序定义的高/低甲基化位点，结果显示，超甲基化 CpG 在位置0的平均切割比例约是低甲基化 CpG 的两倍；而在位置-1，其切割比例则显著更低。
• 图 B: 在配对的、未经亚硫酸氢盐处理的测序数据中，也观察到了完全相同的模式。
• 图 C: 对于包含两个串联 CpG 的窗口，同样观察到，只有当 CpG 被甲基化时，其胞嘧啶位置的切割比例才会显著升高。

DNA 甲基化与 cfDNA 的切割模式直接相关。超甲基化与 CpG 位点自身的高切割率和其上游一位的低切割率相关。

3.2 cfDNA 的 CGN/NCG 基序比反映其甲基化水平

作者进一步验证了 CGN/NCG 基序比作为甲基化水平代理指标的有效性。

• 图 B: 超甲基化 CpG 位点的 CGN/NCG 基序比显著高于低甲基化位点（中位数4.70 vs. 1.31）。
• 图 C, D: 在全基因组、Alu 区域和 CpG 岛三个具有不同天然甲基化水平的区域中，CGN/NCG 基序比的变化趋势与亚硫酸氢盐测序测得的甲基化密度完全一致。
• 图 E, 3F: 在一个具有基因组印记 (genomic imprinting) 的区域（GNAS 基因），来自不同亲本、具有相反甲基化状态的等位基因，其 cfDNA 片段的 CGN/NCG 基序比也表现出预期的相反模式。
• 图 G: 在孕妇血浆中，胎儿特异性 cfDNA 的 CGN/NCG 基序比与从绒毛膜绒毛（胎盘组织）中测得的甲基化水平高度相关。

CGN/NCG 基序比能够可靠地反映基因组区域的甲基化水平，甚至能够反映等位基因特异性的甲基化模式。

3.3 DNASE1L3 在甲基化感知片段化中扮演角色

作者分析了 DNASE1L3 核酸酶缺陷患者的血浆 DNA，以探究该酶在甲基化感知切割中的作用。在 DNASE1L3 缺陷患者中，超甲基化和低甲基化 CpG 位点之间切割谱的差异，以及 CGN/NCG 基序比的差异，都大大减小了。

DNASE1L3 的活性是影响甲基化感知切割的另一个重要因素。在解释切割谱时，需要考虑核酸酶活性的影响。

3.4 甲基化感知的切割模式揭示了 cfDNA 的组织来源

在肝移植患者模型中，作者验证了利用组织特异性的切割谱来追踪 cfDNA 组织来源的可行性。

• 图 A, B: 在肝脏特异性超甲基化的 CpG 位点上，来自供体（肝脏）的 cfDNA 表现出典型的“高0、低-1”切割模式，其 CGN/NCG 基序比与供体 DNA 比例呈强正相关 ($r=0.92$)。
• 图 C, D: 在肝脏特异性低甲基化的 CpG 位点上，则观察到相反的模式，其 CGN/NCG 基序比与供体 DNA 比例呈强负相关 ($r=-0.87$)。

在孕妇模型中，也得到了与肝移植模型完全一致的结论。胎盘特异性甲基化位点的 CGN/NCG 基序比与胎儿 DNA 比例高度相关。此外，图 E, F 显示，即使在非常低的测序深度下（0.05X-0.5X），这种相关性依然很强。

cfDNA 的切割谱能够有效地用于推断 cfDNA 分子的组织来源。

3.5 CGN/NCG 基序比异常的临床意义

作者探讨了利用 CGN/NCG 基序比进行癌症检测的临床应用潜力。

• 图 A, B: 在肝细胞癌（HCC）患者中，由于肿瘤通常表现为低甲基化，其 Alu 区域的 CGN/NCG 基序比与肿瘤分数呈强负相关 ($r=-0.88$)。
• 图 C, D: 利用 SVM 模型和所有 CG 相关的末端基序，在区分 HCC 患者和非 HCC 个体方面，取得了0.98的 AUC，显著优于之前报道的 MDS 指标。
• 图 E, F: 在鼻咽癌（NPC）的筛查中，通过将 EBV 病毒 DNA 的 CGN/NCG 基序比与已有的生物标志物相结合，能够将阳性预测值 (PPV) 从19.6%提高到26.8%。

基于 cfDNA 切割模式的分析，为癌症检测和筛查提供了一个强大的新维度。

3.6 使用深度学习模型在单 CpG 分辨率上预测甲基化状态

作者最终评估了其 CNN 模型在单个 CpG 分辨率上预测甲基化状态的能力。

• 图 A: ROC 分析显示，使用切割谱作为输入的 CNN 模型，其 AUC 达到了0.93，远高于仅使用序列上下文的模型（AUC=0.72）。
• 图 B: 模型输出的甲基化分数与亚硫酸氢盐测序测得的甲基化密度高度一致。

利用 cfDNA 的片段组学模式，通过深度学习算法，在单个 CpG 水平上推断甲基化状态是完全可行的。