Fragle: 使用片段组学深度学习进行通用ctDNA定量.

paper：Fragle: Universal ctDNA quantification using deep learning of fragmentomic profiles

0. TL; DR

本文介绍了一种名为 Fragle 的超快速深度学习方法，它能够直接从血浆游离DNA（cfDNA）的片段长度分布中，精准地量化循环肿瘤DNA（ctDNA）的水平。

作者在一个包含多种癌症类型和健康对照的大型 lpWGS 数据集上，通过计算机模拟数据增强（in-silico data augmentation）策略开发了 Fragle。在独立的验证队列中，Fragle 的准确性和检测下限均优于现有的肿瘤未知方法。

1. 背景介绍

通过量化血浆中的循环肿瘤DNA（ctDNA）水平，可以实现对癌症进展的无创动态监测，这对于指导治疗和临床试验至关重要。然而，精准的 ctDNA 定量并非易事，不同的测序策略带来了不同的挑战。

靶向测序 (Targeted Sequencing)：这是临床上最常用的方法，通过对一组已知的癌症相关基因进行超深度测序，来寻找肿瘤特异性的突变。
- 优点：能够发现可指导用药的“可操作性突变”（actionable mutations）。
- 局限性：
  - 覆盖度有限：并非所有肿瘤都携带有特定 panel 所覆盖的突变。
  - 定量不准确：直接使用突变的等位基因频率（variant allele frequencies, VAFs）来估算 ctDNA 水平，会受到肿瘤克隆性、拷贝数变异以及克隆性造血（clonal hematopoiesis）等因素的严重干扰。
  - 兼容性差：现有的ctDNA定量工具大多不兼容靶向测序数据。
肿瘤未知方法 (Tumor-naïve methods)：这类方法无需预先知道肿瘤的突变信息，而是通过分析全基因组范围内的特征来定量 ctDNA。通常需要低深度全基因组测序（low-pass whole genome sequencing, lpWGS）或DNA甲基化测序（DNA methylation profiling）。片段组学（Fragmentomics）是其中的关键。大量研究已证实，来源于癌细胞的 cfDNA 片段在长度分布上与正常细胞存在显著差异（如更短、10-bp振荡幅度更高等）。

当前的核心矛盾在于临床上最常用的靶向测序，却缺乏与之配套的、准确的、不依赖于VAF的ctDNA定量工具。开发一种能够跨越不同测序平台，无论是 lpWGS 还是靶向测序，都能精准定量 ctDNA 的通用方法，是液体活检领域亟待解决的关键问题。

为此，作者开发了 Fragle，一个基于深度学习的多阶段模型，其目标正是要打破平台壁垒，仅利用所有测序数据中都普遍存在的片段长度信息，来实现对 ctDNA 水平的精准、通用和超快速的定量。

2. Fragle 架构

Fragle 的核心是一个多阶段的机器学习模型，它以 cfDNA 的片段长度密度分布作为唯一输入，通过深度学习来预测样本中的 ctDNA 水平。其开发流程如图所示。

2.1 训练数据的构建

为了训练一个能够应对各种 ctDNA 浓度的强大模型，作者采用了一种大规模的计算机模拟数据增强（in-silico data augmentation）策略。

作者首先收集了一个包含325个癌症样本（涵盖结直肠癌、乳腺癌、肝癌和卵巢癌）和101个健康对照样本的 lpWGS 数据作为发现队列（discovery cohort）。

利用 ichorCNA 等多种方法估算这些样本的黄金标准ctDNA 水平，并筛选出 ctDNA 含量较高（$\ge 3\%$）的癌症样本。通过将高 ctDNA 含量的癌症样本测序数据与健康对照的测序数据按不同比例进行数字混合，作者生成了约4000个具有已知 ctDNA 分数（从 $10^{-6}$ 到原始浓度）的模拟样本。

2.2 特征提取

对于每个样本，首先计算所有双端测序读段（paired-end reads）的插入片段长度，生成一个覆盖51-400 bp范围的原始片段长度密度分布。

将每个样本的分布除以其最高峰的计数值。进行 log10 缩放。使用一个32-nt的滑动窗口进行z-score平滑处理。最后，相对于整个训练集的分布进行标准化。

通过这一系列变换，作者旨在放大与 ctDNA 水平相关的局部差异，同时抑制样本间的技术噪音。

2.3 Fragle的多阶段模型架构

Fragle 的独特之处在于其两阶段、三模型的架构，旨在同时优化对高、低 ctDNA 浓度样本的预测精度。

第一阶段：双并行子模型

作者并行训练了两个独立的神经网络子模型：

低ctDNA负荷子模型 (low ctDNA burden sub-model)

该模型的损失函数是相对平均绝对误差（Relative MAE）：

\[Relative MAE = \frac{(MAE + \sigma)}{(true\_fraction + \sigma)}\]

这个损失函数对 ctDNA 分数较低的样本的预测误差更为敏感（因为分母更小），从而迫使模型优先优化在低浓度区间的准确性。

高ctDNA负荷子模型 (high ctDNA burden sub-model)

该模型使用标准的平均绝对误差（Mean Absolute Error, MAE）作为损失函数，更侧重于优化高浓度样本的预测。

这两个子模型的网络结构相同，均包含16个带批归一化（batch normalization）和残差连接（residual connections）的全连接层，并使用 Dropout 防止过拟合。

第二阶段：选择模型

对于一个给定的样本，第一阶段的两个子模型会分别给出一个预测的 ctDNA 分数。这两个分数共同构成了选择模型的输入特征。

采用一个二元支持向量机（Support Vector Machine, SVM）分类器。训练时，将真实 ctDNA 分数 $< 3\%$ 的样本标记为0，$\ge 3\%$ 的样本标记为1。

该 SVM 模型的作用是判断当前样本更可能属于“低浓度”还是“高浓度”区间，并据此选择相应子模型的输出作为最终的 Fragle 预测结果。

通过这种精巧的多阶段设计，Fragle 成功地结合了两个“专家”模型的优势，在整个 ctDNA 浓度范围内都实现了高精度的定量。

3. 实验分析

作者在一系列独立的数据集和临床场景中，对 Fragle 的性能进行了全面的验证。

3.1 在lpWGS数据上的高精度与泛化性

作者首先在多个独立的、未用于训练的 lpWGS 队列中测试了 Fragle 的性能。

图a-d (交叉验证)：在发现队列的交叉验证中，Fragle 对四种癌症（CRC, BRCA, HCC, OV）的预测值与真实值之间均表现出高度相关性（皮尔逊相关系数 r 在0.81到0.94之间）。
图e-h (独立队列验证)：在多个独立的癌症队列中，Fragle 的预测结果与金标准方法 ichorCNA 的结果高度一致，相关系数 r 值在0.72到0.86之间。
图i (与VAF的比较)：在一个同时拥有 lpWGS 和靶向测序数据的 CRC 队列中，Fragle 从 lpWGS 预测的 ctDNA 水平与靶向测序检测到的最大VAF高度相关（$r = 0.88$）。
图j (与分期的关系)：Fragle 预测的 ctDNA 水平与肿瘤分期呈正相关，晚期肿瘤的 ctDNA 水平显著更高。
Fragle 仅需约 50万条读段（约0.05X WGS）即可达到与1X WGS 数据相当的预测精度，且计算速度极快（单核CPU处理1X样本仅需约50秒）。

3.2 卓越的检测下限 (LoD)

图a, b (验证集评估)：在交叉验证集中，Fragle 能够有效区分健康样本和 ctDNA 含量低至1%的癌症样本（$P = 2.5 \times 10^{-24}$），其分类 AUC 达到0.93，优于 ichorCNA (0.88)。
图c (独立测试集评估)：在一个独立的测试集上，Fragle 的分类 AUC 高达0.96，显著优于 ichorCNA (0.85) 和其他基于片段组学特征的模型 (0.81)。
图d (in silico稀释)：在计算机模拟稀释实验中，Fragle 能在0.5-1%的 ctDNA 水平上实现对健康样本的显著区分。
图e, f (in vitro稀释)：在两个使用真实血浆进行的体外稀释实验中，Fragle 再次证明了其能够精准定量低至约1%的 ctDNA，并且在多个技术重复中表现稳定。

综合多种证据，Fragle 的检测下限（LoD）约为1%。

3.3 Fragle在靶向测序数据上的突破性应用

图b (On-target reads)：直接使用靶向测序的靶上读段（on-target reads）进行分析，会导致 Fragle 严重高估 ctDNA 水平。
图c (Off-target reads)：当作者转而使用被传统分析流程丢弃的脱靶读段（off-target reads）时，Fragle 的预测结果与来自同一样本的 lpWGS 数据的预测结果高度一致！在四个不同的队列中，相关系数 r 值均在0.86到0.97之间。
图d (商业化panel验证)：作者进一步在一个使用商业化液体活检 panel（Foundation Medicine）的数据集上进行了验证。Fragle 利用脱靶读段预测的 ctDNA 水平，与该 panel 报告的最大VAF也表现出良好的相关性（$r = 0.62$）。

这些结果首次证明，仅利用靶向测序数据中常被忽略的脱靶读段，就足以通过 Fragle 实现精准的 ctDNA 定量。这一发现极大地扩展了 Fragle 的适用范围，使其能够赋能临床上更常见的靶向测序应用。

3.4 临床应用：动态监测与风险分层

作者展示了 Fragle 在两个关键临床场景中的应用价值。

ctDNA动态监测：在多名接受治疗的晚期结直肠癌患者的纵向样本中，Fragle 利用靶向测序的脱靶读段预测的 ctDNA 水平动态变化，与影像学评估的治疗反应（如部分缓解、疾病进展）以及VAF的变化趋势高度一致。在某些 VAF 信号不稳定或检测失败的情况下，Fragle 提供了一个正交且独立的定量指标。

MRD风险分层：在一个包含162名已手术的早期肺癌患者队列中，所有样本在术后约30天时通过一个商业化的肿瘤未知 panel 进行 MRD 检测，结果均为 ctDNA 阴性。然而，当作者使用 Fragle 对这些“阴性”样本的脱靶读段进行分析时，成功地将其分为了“Fragle-高 ctDNA”（>1%）和“Fragle-低 ctDNA”（<1%）两组。

Kaplan-Meier 生存分析显示，被 Fragle 判为“高 ctDNA”的患者，其无病生存期（DFS）显著差于“低 ctDNA”组（$P = 0.035$）。

这一结果表明，Fragle 能够作为现有 MRD 检测方法的有力补充，在所谓的“ctDNA阴性”人群中，进一步识别出具有高复发风险的患者。