利用深度学习对cfDNA进行全面的组织解卷积用于疾病诊断和监测.

paper：Comprehensive tissue deconvolution of cell-free DNA by deep learning for disease diagnosis and monitoring

0. TL; DR

本文基于521个涵盖29种主要人体组织的非癌样本构建了一个全面的、高分辨率的组织甲基化图谱，并基于此开发了首个用于血浆游离DNA（cfDNA）组织溯源的监督式深度学习模型cfSort。

通过在基准数据上的测试，cfSort 在灵敏度和准确性上均显著优于现有方法。作者在两个临床应用场景中验证了 cfSort 的实用价值：

辅助疾病诊断：cfSort 能够成功识别出癌症和肝硬化患者血浆中来自患病组织的 cfDNA 比例显著升高。
监测治疗副作用：在接受免疫治疗的非小细胞肺癌患者中，cfSort 估算的组织来源 cfDNA 比例变化与反映肝、肾损伤的生化指标高度一致。

1. 背景介绍

血液中漂浮的细胞游离DNA（cfDNA）是体内所有组织细胞死亡后释放的遗传物质碎片。由于癌症、自身免疫病等多种疾病及其治疗过程会影响特定组织的细胞死亡率，因此，血液中来自这些组织的 cfDNA 比例也会相应改变。通过精确解析 cfDNA 的组织来源，即组织解构（tissue deconvolution），我们就能获得一张反映全身组织健康状况的快照，这在疾病的诊断、预后和治疗监测中具有巨大的临床潜力。

然而，cfDNA 的组织溯源之路并非一帆风顺，主要面临两大挑战：

信号微弱，背景噪声巨大：来自实体器官的 cfDNA 在血浆中占比极低，而超过85%的 cfDNA 来自于血细胞，这使得来自病变组织的微弱信号极易被淹没。
多组织来源的复杂性：人体所有组织都可能释放 cfDNA，因此需要一个能够同时解构尽可能多组织类型的全面模型，才能获得准确的结果。

DNA甲基化（DNA methylation）因其高度的组织特异性，成为追踪 cfDNA 来源的关键。尽管已有一些基于甲基化的组织解构方法，如非负最小二乘法和似然模型，但它们的灵敏度和准确性仍有待提高。这主要源于三个根本性限制：

依赖无监督方法：现有方法均为无监督模型，在模型的效力、泛化能力和抗噪声方面天生弱于监督式方法。
组织甲基化图谱不完整：以往的研究通常只包含少数几种组织的少量样本，无法充分代表组织间的个体差异。
缺乏高分辨率数据：高分辨率的甲基化图谱仅限于少数组织，这限制了对组织特异性甲基化模式的全面刻画。

为了彻底解决这些问题，作者从两个层面入手：首先，构建一个前所未有的全面、高分辨率的组织甲基化图谱；其次，基于该图谱，开发首个用于 cfDNA 组织解构的监督式深度学习模型 cfSort。

2. 从组织甲基化图谱到cfSort模型

作者的工作分为两个紧密相连的部分：构建全面的组织甲基化图谱，以及开发基于该图谱的 cfSort 模型。

2.1 构建全面的组织甲基化图谱

作者首先通过对来自 GTEx 项目的521个非癌组织样本（涵盖29种主要人体组织，包括8种全新的组织类型）进行高分辨率的 RRBS（Reduced Representative Bisulfite Sequencing）测序，构建了一个庞大的组织甲基化数据库。

与传统方法在基因组区域层面计算平均甲基化水平不同，作者采用了片段级甲基化分析（fragment-level methylation analysis）。这种方法通过量化单个DNA片段上的甲基化程度，能够灵敏地捕捉到即使是存在于组织中少数细胞亚群的特异性信号，从而有效克服组织异质性带来的干扰。

为了构建一个全面的标志物图谱，作者采用了三种互补的标志物发现策略：

策略一 (Type I markers)：一对多。识别在某一种组织中特异性甲基化，而在所有其他组织中均无此模式的标志物。
策略二 (Type II markers)：组对组。根据组织在胚胎发育过程中的亲缘关系（组织系统发育树，tissue phylogeny），识别在某一组织群（如消化系统）与另一组织群（如淋巴系统）之间存在差异甲基化的标志物。
策略三 (Type III markers)：一对一。识别在两种相似或相邻组织（如食道和胃）之间存在差异的标志物。

最终，作者筛选出了一个包含51,035个高质量标志物的综合图谱，为后续的监督学习奠定了坚实的数据基础。

2.2 cfSort模型

由于无法获取真实 cfDNA 样本的金标准组织成分，应用监督学习的最大挑战是缺乏训练数据。作者通过一个精巧的计算机模拟（in silico）策略解决了这个问题。

2.2.1 计算机模拟生成海量训练数据

作者利用构建好的组织甲基化图谱，通过以下四步生成了数十万个具有已知组织成分的模拟 cfDNA 样本：

随机选择贡献组织：除了始终作为主要成分的白细胞（WBC），随机选择1到9种其他组织。
随机选择组织样本：从每种被选中的组织类型中，随机挑选一个真实的组织样本作为DNA来源。
生成随机组织成分：遵循狄利克雷分布（Dirichlet distribution），为所选组织生成一组随机的比例，并确保 WBC 的比例始终最高（平均75%），以模拟真实血浆情况。
混合生成模拟样本：根据生成的组织比例，从对应的真实组织样本测序数据中按比例随机抽样 DNA 片段，最终混合成一个模拟的 cfDNA 样本。

通过这种方式，作者生成了超过29万个多样化的训练样本，充分覆盖了各种可能的组织组合、个体差异和实验噪声，为训练一个鲁棒的深度学习模型提供了保障。

2.2.2 特征构建与DNN架构

为了抵抗核小体定位等因素造成的局部信号波动，作者没有直接使用单个标志物，而是通过约束K-均值聚类（constrained K-means clustering）将4到7个邻近的标志物合并成一个标志物簇（marker cluster）。对每个样本，计算其在所有10,183个标志物簇上的组织特异性片段比例，形成最终的输入特征谱。

cfSort 的核心是一个由两个独立的深度神经网络（DNN）组成的集成模型，以降低预测方差。每个 DNN 包含：

三个密集隐藏层，节点数递减，并使用 ReLU 激活函数。
每个隐藏层前加入批归一化层（batch normalization layer），以加速和稳定训练。
每个隐藏层后加入Dropout层，以防止过拟合。
输出层包含29个节点，对应29种组织的比例，并使用 softmax 激活函数。

使用 Adam 优化器和平均绝对误差（mean absolute error）作为损失函数。同时采用early stopping策略，有效防止模型在训练数据上过拟合。

3. 实验分析

作者从多个维度对新建的组织甲基化图谱和 cfSort 模型进行了全面的验证。

3.1 组织甲基化图谱的全面验证

图B (可重复性)：在独立的 Epigenome Roadmap 项目的 WGBS 数据中，作者图谱中92.9%的标志物表现出了一致的组织特异性甲基化模式。
图C (与组蛋白修饰的关联)：93.7%的标志物与 ENCODE 项目中的组织特异性 H3K27ac 修饰（一种与转录激活相关的标记）表现出预期的一致性（低甲基化区域对应高 H3K27ac 信号）。
图D (与基因表达的关联)：在 GTEx 项目的 RNA-seq 数据中，63.0%的标志物显示，当其所在启动子区域为低甲基化时，对应基因的表达水平显著升高。
图E (与转录调控的关联)：通过 HOMER 进行的基序富集分析发现，标志物区域富集了大量与组织发育、分化和特异性表达相关的转录因子结合基序。

这一系列多维度的验证雄辩地证明，作者构建的组织甲基化图谱是准确、可重复且具有深刻生物学意义的。

3.2 cfSort的分析性能评估

作者在一个独立的模拟测试集上，将 cfSort 与现有的两种主流无监督方法（NNLS 和 CelFiE）进行了性能比较。

图A (准确性)：在所有三个评估指标（平均绝对误差、林氏一致性相关系数、皮尔逊相关系数）上，cfSort 的表现均显著优于 NNLS 和 CelFiE，表明其估算的组织成分比例更准确。
图B-D (检测限)：在20倍测序深度下，cfSort 能够检测到低至0.1%的组织来源 cfDNA 信号 ($P=0.028$)，而 NNLS 和 CelFiE 的检测限分别为5%和0.5%。这表明 cfSort 具有超高的灵敏度。

作者进一步评估了 cfSort 对局部信号波动的鲁棒性。通过构建具有相同总体成分但局部片段分布不同的模拟样本对进行测试。cfSort 对这两类样本的预测结果高度一致（回归线的截距接近0，斜率接近1，R²=0.99），证明 cfSort 不受局部随机波动的干扰，具有强大的泛化能力。

3.3 cfSort的临床应用验证

3.3.1 在疾病诊断中的应用

作者将 cfSort 应用于来自健康人、肝硬化患者和四种癌症（肺癌、肝癌、结直肠癌、胃癌）患者的真实血浆 cfDNA 甲基化测序数据。

图A-E (cfMethyl-Seq数据)：在所有五种疾病中，患者队列中来自相应患病组织（肝、肺、肠、胃）的 cfDNA 比例，均显著高于健康对照组（所有P值均极小）。使用该组织比例作为单一预测指标，可以有效地将患者与健康人区分开来（AUC 值均较高）。
图F (WGBS数据)：在另一个采用不同测序技术（WGBS）的肝癌数据集中，cfSort 同样成功识别出患者升高的肝源性 cfDNA 比例。这证明了 cfSort 强大的跨平台适用性。

3.3.2 在治疗副作用监测中的应用

作者将 cfSort 应用于4名接受抗PD-1免疫治疗的NSCLC患者在治疗过程中的连续血浆样本，重点关注常见的肝、肾损伤副作用。

图A (肝损伤)：在3名经生化指标确诊有肝损伤的患者中，cfSort 均检测到了其肝源性 cfDNA 比例的同步升高。
图B (肾损伤)：在1名确诊有肾损伤的患者中，cfSort 同样检测到了肾源性 cfDNA 比例的升高；而在另外3名无肾损伤的患者中，其肾源性 cfDNA 比例则保持在低水平或未检出。

这项初步的案例研究首次展示了利用 cfDNA 组织溯源来动态监测癌症治疗对非癌组织的副作用的潜力，这对于那些缺乏标准生化监测指标的器官损伤尤其具有重要意义。