EM-DeepSD：基于cfDNA末端基序信号分解的深度神经网络模型用于癌症诊断.

paper：EM-DeepSD: A Deep Neural Network Model Based on Cell-Free DNA End-Motif Signal Decomposition for Cancer Diagnosis

0. TL; DR

本文介绍了一种名为 EM-DeepSD 的新型深度学习框架，专为通过血浆游离DNA（cfDNA）的末端基序谱进行癌症诊断而设计。EM-DeepSD 框架包含三大核心模块：

信号分解模块：将原始复杂的末端基序谱分解并重构为多个更具规律性的子序列，以优化后续的建模过程。
机器学习模块：利用多种机器学习算法从子序列中提取信息。
深度学习模块：通过 LSTM 和自注意力机制整合特征，最终输出诊断结果。

作者基于此框架开发了一个具体模型 EM-DeepSSA，并在一个包含146名癌症患者和122名对照的内部验证集上进行了测试。结果显示，EM-DeepSSA 的性能显著优于现有的基准方法。更重要的是，在两个采用不同测序技术（5hmCS 和 BR-cfDNA-Seq）的独立外部测试集上，EM-DeepSSA 同样展现出卓越的性能。

这项研究表明，通过信号分解增强 cfDNA 特征，并结合深度学习进行建模，是一种能够实现高精度、跨平台癌症诊断的有效策略。

1. 背景介绍

血浆游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）作为一种液体活检标志物，因其独特的片段化模式在癌症诊断领域备受关注。研究表明，与拷贝数变异或片段长度等其他特征相比，cfDNA的片段化模式在癌症诊断中表现出更优越的性能。

cfDNA的片段化并非随机过程，它与DNA核酸酶的活性密切相关。其末端序列，即末端基序（end-motifs, EMs），在癌症患者和健康个体中存在显著差异。

然而，现有的基于末端基序的诊断方法仍面临两大挑战：

信息提取的局限性：像 MDS 这样的方法主要关注基序的多样性，可能会忽略其他重要信息。而基于特定疾病（如小鼠模型）构建的 F-profiles 在应用于更广泛的癌症诊断时可能存在局限性。
高维复杂性：末端基序谱本身是高维度的复杂序列。直接将其输入传统的机器学习（ML）模型，模型的性能往往受限于数据的复杂性和噪音，难以在不同的数据集上都取得高精度的预测结果。

为了克服这些挑战，迫切需要开发能够更全面、更深入地利用末端基序谱中复杂信息的新方法。信号分解技术作为一种能将复杂序列分解为多个更规则、更易于分析的子序列的强大工具，已在工程、金融乃至医学信号处理（如脑电、心电图）领域取得了巨大成功。与此同时，深度学习技术，特别是结合了LSTM（长短期记忆网络）和Attention（注意力机制）的模型，在处理序列数据方面展现了卓越的能力。

受此启发，本研究创造性地将信号分解技术引入 cfDNA 片段组学分析，并提出了一个全新的EM-DeepSD（End-Motif Signal Decomposition Deep Learning）框架。该框架旨在通过分解、重构和深度建模，从根本上提升基于末端基序的癌症诊断精度。

2. EM-DeepSD 框架

2.1 输入数据的准备

对原始测序数据进行质量控制，去除接头和低质量碱基。使用 Bowtie2（用于WGS, 5hmCS, BR-cfDNA-Seq）或 Bismark（用于WGBS）将读段比对到参考基因组（hg19），并去除PCR重复。

从每个 cfDNA 片段的5’端（包括Watson和Crick链）提取4-mer基序，共计256种。计算每个样本中256种 EM 的频率，并按照固定的碱基序列顺序（如AAAA, AAAC, …）排列，形成每个样本的原始输入信号EM谱，即一个长度为256的向量。

2.2 EM-DeepSD的核心模块

EM-DeepSD 是一个包含三个核心模块的深度学习架构，旨在通过对末端基序（EM）谱的逐层处理，渐进式地提升癌症诊断的准确性。

模块一：信号分解模块 (Signal Decomposition Module)

该模块旨在将原始复杂、不规则的 EM 谱分解为多个更简单、更具规律性的子序列。作者探索了两种经典的信号分解方法：

奇异谱分析 (Singular Value Decomposition, SSA)

SSA 是一种强大的时间序列分析技术，其处理过程分为三步：

嵌入 (Embedding)：将一维的 EM 谱 $X = (X_1, X_2, \dots, X_N)$（其中 $N=256$）转换为一个轨迹矩阵。这通过一个长度为 $L$ 的滑动窗口来实现。本文中，窗口长度 $L$ 设为8。 $X = \begin{bmatrix} X_1 & X_2 & \dots & X_K \\ X_2 & X_3 & \dots & X_{K+1} \\ \vdots & \vdots & \ddots & \vdots \\ X_L & X_{L+1} & \dots & X_N \end{bmatrix}$
奇异值分解 (Singular Value Decomposition)：对轨迹矩阵 $X$ 进行奇异值分解。
分组与对角平均 (Grouping and Diagonal Averaging)：根据奇异值的贡献率，将分解后的成分分组，然后通过反对角线平均重构，得到多个长度为 $N$ 的子序列。在本研究中，作者将8个奇异值分成了三组（第1个，第2-3个，第4-8个），从而重构出三个子序列。

经验模态分解 (Empirical Mode Decomposition, EMD)

EMD 是一种自适应的信号处理方法，它将原始序列 $X(N)$ 分解为一系列具有不同时间尺度的内禀模态函数（Intrinsic Mode Functions, IMFs）和一个残差项 $Rse_M(N)$。

\[X(N) = \sum_{m=1}^{M} IMF_m(N) + Rse_M(N)\]

分解过程通过一个筛分迭代过程实现，不断提取信号的局部高频和低频成分。考虑到不同样本分解出的 IMF 数量可能不同，作者引入了排列熵（Permutation Entropy, PE）来对分解出的 IMF 进行重构，将它们合并为两个新的子序列：高PE序列（$PE \ge 0.8$）和低PE序列（$PE < 0.8$）。

基于 SSA 和 EMD 两种不同的信号分解方法，作者最终构建了两个具体的模型：EM-DeepSSA 和 EM-DeepEMD。

模块二：机器学习模块 (Machine Learning Module)

该模块旨在从信号分解模块产生的各个子序列中提取有价值的诊断特征。

作者为每个子序列（例如，SSA 产生的3个子序列）分别训练了5种不同的 ML 算法模型，包括线性的 LASSO、EN（弹性网络），以及非线性的 RF（随机森林）、XGBoost（极限梯度提升）和 MLP（多层感知器）。

之所以采用多种 ML 模型，是因为单一模型往往只能从特定角度提取信息，难以全面捕捉复杂数据的所有特征。通过并行训练多个模型，可以充分利用不同算法的优势，为后续的深度学习模块提供更丰富、更多样化的输入。

每个 ML 模型都会对输入的子序列给出一个预测概率。这些概率值将作为下一阶段深度学习模块的输入特征。

模块三：深度学习模块 (Deep Learning Module)

这个模块整合了来自 ML 模块的所有信息，以做出最终的癌症诊断。其架构依次包含 LSTM 层、自注意力层、全局平均池化层和全连接层。

LSTM 以其独特的记忆单元和门控机制，擅长捕捉序列中的长程依赖关系。它接收来自 ML 模块的多个预测概率作为输入序列，并学习这些特征之间的时序或依赖关系。其核心计算公式如下：

\[\begin{cases} F_m = \sigma(X_m W_{xf} + H_{m-1} W_{hf} + b_f) \\ I_m = \sigma(X_m W_{xi} + H_{m-1} W_{hi} + b_i) \\ O_m = \sigma(X_m W_{xo} + H_{m-1} W_{ho} + b_o) \end{cases}\]

其中 $F_m, I_m, O_m$ 分别代表遗忘门、输入门和输出门。

自注意力层接收来自 LSTM 层的输出，并动态地计算序列中每个元素（即每个ML模型的输出）的重要性。通过计算查询（Q）、键（K）、值（V）之间的点积注意力，模型能够捕捉全局依赖关系，为重要的特征分配更高的权重。

\[SelfAttn(Q, K, V) = softmax(\frac{Q K^T}{\sqrt{d_k}})V\]

全局平均池化层将自注意力层加权后的特征图进行降维，有效减少模型参数，防止过拟合。最后通过一个带有 sigmoid 激活函数的全连接层，输出最终的癌症预测概率。

3. 实验分析

作者在一个包含268个样本（146个癌症，122个对照）的数据集中对 EM-DeepSD 框架进行了开发和验证。训练集和内部验证集来自 WGS 和 WGBS 数据，另外还有两个独立的外部测试集，分别采用 5hmCS 和 BR-cfDNA-Seq 技术。

3.1 EM谱的差异分析

在训练集上，作者首先比较了癌症组和对照组的 EM 谱差异。

热图显示，在256个 EM 中，有41个在癌症组中频率显著升高，27个显著降低。整体趋势是，以胸腺嘧啶（T）开头的 EM 在癌症组中上调，而以胞嘧啶（C）开头的 EM 则下调。

箱线图展示了差异最显著的10个 EM。TAAA, TGGA 等5个基序在癌症组中频率显著升高，而 CCCA, CCCT 等5个基序则显著降低。这证实了 EM 谱作为癌症生物标志物的潜力。

3.2 信号分解的效果分析

作者以一个样本为例，展示了信号分解的效果。

图A-C (SSA分解)：SSA 将原始 EM 谱分解为三个特征各异的子序列：SSA1 捕捉了信号的主要趋势（全局特征），SSA2 突出了峰和谷（局部特征），而 SSA3 则揭示了隐藏在原始信号中的高频抖动（精细特征）。
图D,E (EMD分解)：EMD 分解也得到了两个具有不同特征的子序列。

总的来说，信号分解成功地将一个复杂的信号拆解成了多个结构更简单、规律性更强的成分。信号分解显著增加了可用于诊断的有效信息。原始 EM 谱中只有68个差异显著的 EM，而经过 SSA 和 EMD 分解后，子序列中差异显著的 EM 数量分别增加到了169个和81个。

图B-D：作者基于分解后的子序列构建了7种新的优化 MDS（MDS-SDs）。与原始 MDS 相比，这些 MDS-SDs 在癌症组和对照组之间的差异更为显著。
图E：在诊断性能上，大多数 MDS-SDs 的 AUC 值都高于原始的 MDS。这初步证明了信号分解在提升诊断准确性方面的潜力。然而，这种提升并不显著，表明仅靠多样性评分仍无法完全利用信号分解带来的信息增益。

3.3 机器学习模块的性能评估

为了充分利用子序列中的信息，作者为每个子序列都训练了 ML 模型。

图A (SSA-based ML) 和 图B (EMD-based ML)：热图展示了25个 ML 模型在三个数据集（验证集、测试集-1、测试集-2）上的 AUC 值。在验证集上，有20个模型的性能显著优于基准方法。然而，这些 ML 模型在不同的外部测试集上表现出不稳定性。例如，LASSO 和 EN 模型在测试集-1上表现优异，但在测试集-2上表现不佳；而 RF 和 XGBoost 模型则正好相反。这表明，单一的 ML 模型难以适应所有的数据场景和测序类型，凸显了开发一个能整合多模型优势的集成框架（即EM-DeepSD）的必要性。

3.4 EM-DeepSD框架的最终性能验证

作者最终评估了 EM-DeepSD 框架开发的两个模型（EM-DeepSSA 和 EM-DeepEMD）的性能。

在所有测试场景中，EM-DeepSSA 表现最佳，全面超越了基准方法和 EM-DeepEMD。

图A (验证集)：EM-DeepSSA 的 AUC 达到 0.920 (95% CI: 0.853–0.987)，显著优于 MDS 和 F-profile 2。
图B (测试集-1, 5hmCS)：EM-DeepSSA 的 AUC 达到 0.933 (95% CI: 0.853–1.000)，再次显著胜出。
图C (测试集-2, BR-cfDNA-Seq)：EM-DeepSSA 的 AUC 高达 0.956 (95% CI: 0.894–1.000)，并实现了100%的灵敏度。

这些结果充分验证了 EM-DeepSSA 在不同测序技术和数据集上的强大、稳健和卓越的诊断性能。