癌症中的细胞游离DNA片段组学.

1. cfDNA片段组学的发展

细胞游离DNA（cfDNA）是指存在于血液、尿液及其他体液中，未被细胞包裹的DNA碎片。早期对cfDNA的兴趣源于几项重大发现：

  1. 通过PCR技术在癌症患者血浆中检测到肿瘤相关基因突变，发现了循环肿瘤DNA（ctDNA）。
  2. 通过PCR技术在母体血浆和血清中检测到Y染色体DNA，发现了胎儿cfDNA。
  3. 通过检测供体特异性遗传变异，在器官移植受者血浆中发现了供体来源的cfDNA。

这些发现推动了用于癌症检测、靶向治疗、产前检测和移植排斥监测的微创液体活检技术的发展。

早期的液体活检方法主要基于遗传差异分析。例如，在癌症检测中，早期工作尝试通过PCR或靶向测序来检测肿瘤特异性遗传变异。然而，这些方法面临两大挑战：

  1. 低变异等位基因频率（VAF）：尤其是在早期癌症患者中，携带肿瘤特异性突变的DNA片段比例非常低，难以与文库构建和测序过程中产生的背景噪音区分。
  2. 肿瘤异质性：靶向方法可能因癌细胞克隆、转移灶和患者个体间的遗传异质性而受限。

这些固有限制推动了研究转向表观遗传（如甲基化）和片段组学cfDNA生物标志物。

cfDNA片段组学是研究cfDNA片段化模式的学科，包括但不限于片段大小、末端基序（end motifs）、末端密度（偏好末端，preferred ends）和核小体占据（nucleosome occupancy）。

图：cfDNA片段化模式被认为与潜在的遗传和表观遗传图谱密切相关，并受到cfDNA产生、释放和清除等特定机制的影响。

早期的cfDNA大小分析显示：

近年来，随着新技术的应用，我们对cfDNA的认识也在不断扩展：

cfDNA的特征性大小谱（核小体峰和10 bp周期性）与经典的核小体结构生化研究以及细胞死亡过程中的DNA片段化现象（如核小体梯）相呼应。普遍认为细胞死亡是cfDNA产生的重要来源。尽管不同细胞死亡模式的相对贡献仍在研究中，但通过小鼠模型已鉴定出一些影响循环cfDNA图谱的核酸酶。例如，Dnase1l3基因敲除小鼠的血浆中双核小体和三核小体DNA分子比例增加，表明DNASE1L3可能在将多核小体单位降解为单核小体cfDNA中起作用。

核酸酶不仅与片段大小有关，还与片段末端的DNA序列模式（末端基序）有关。Dnase1l3敲除小鼠的5’末端基序频率发生显著变化，其中减少最多的4-mer基序都以“CC”开头。后续研究发现，DNASE1和DFFB分别倾向于产生T-末端和A-末端片段。此外，核酸酶活性还与双链cfDNA上的单链悬挂结构（锯齿状末端，jagged ends）有关。由于DNASE1L3在结直肠癌、肺癌、鼻咽癌等多种癌症中表达下调，末端基序谱的改变可能反映了癌症相关的核酸酶表达和活性的变化。

这些发现为cfDNA片段组学模式与基因组调控图谱（如染色质结构和表观遗传修饰）之间的关系提供了生物学基础。早期证据之一是偏好末端的发现：cfDNA末端在某些基因组坐标上过度富集，且其分布在肿瘤和非肿瘤基因组之间存在差异。这种不均匀的cfDNA覆盖模式还可用于核小体和转录因子（TF）足迹分析，可能携带组织或肿瘤特异性特征。

在分子水平上，CpG位点周围的片段化模式取决于其甲基化状态。最近的研究进一步发现，调节染色质可及性的组蛋白修饰也与特定的片段化模式相关。这些关联为直接从cfDNA片段化谱推断RNA表达提供了生物学基础。

总而言之，癌症是一种涉及多种表观遗传和转录组改变以及细胞更新异常的多因素疾病。DNA片段化受染色质结构影响，而染色质结构本身又与DNA甲基化、组蛋白修饰和转录活性密切相关。cfDNA片段组学可能连接了癌症生物学的这些不同方面。

2. 片段组学新特征：开启癌症检测新方法

除了已知的核心片段组学特征（片段大小、末端基序、足迹分析），得益于湿实验和干实验技术的进步，新的片段组学维度不断涌现，为癌症检测提供了新标志物。

2.1 超越核小体的cfDNA片段：超短与长链cfDNA

2.1.1 超短cfDNA

cfDNA的观测大小谱依赖于DNA提取（如硅胶柱 vs. 磁珠）和文库构建方法。例如，常用的硅胶柱法对<50 bp的片段回收率很低。而单链DNA（ssDNA）和带切口的双链DNA无法被传统的双链文库构建方法捕获。

通过应用低分子量核酸提取方法和ssDNA文库构建方案（如SRSLY），研究人员发现了众数大小约为50 nt的超短cfDNA。这些超短cfDNA主要是单链的。然而，通过凝胶电泳对双链cfDNA文库进行手动大小筛选，也发现了长度为20-60 bp的双链cfDNA。

血浆超短cfDNA在基因组上的分布并非随机，通常富集在启动子区域。有趣的是，晚期癌症患者中，转录起始位点（TSS）上游250 bp范围内的超短cfDNA覆盖度显著降低，这可能与疾病分期相关。超短ssDNA可能源于TSS上游的G-四链体（G-quadruplexes）结构，而超短dsDNA不仅富集在活性启动子和TSS，还富集在特定的转录因子（TF）结合位点。通过分析这些位点的超短dsDNA富集情况，可以识别出组织特异性的肿瘤信号通路，例如，在结直肠癌（CRC）中富集SP1和FOSL1/2，在胰腺导管腺癌（PDAC）中富集RBPJ。

超短cfDNA的另一个临床相关特性是它易于通过肾小球滤过屏障，成为尿液中的跨肾cfDNA（transrenal urinary cfDNA）。尿液cfDNA的片段通常比血浆cfDNA更短（众数约81 bp），且主要反映DNASE1而非DNASE1L3的切割模式。最新研究发现，尿液中存在更短的（<50 nt/bp）跨肾cfDNA。由于小分子更容易通过肾小球，选择性分析尿液中的超短cfDNA可以富集非泌尿系统癌症的拷贝数变异信号。此外，由于附着在cfDNA上的组蛋白可能阻碍其跨肾渗透，分析尿液中与血液特异性异染色质区（HCRs）对应的cfDNA，可以增强对膀胱癌等泌尿系统癌症的甲基化检测。

在一项膀胱癌研究中，研究人员定义了一种cfDNA片段化热点积分（IFS），结合了覆盖度和平均片段大小。结果显示，基于尿液热点的机器学习模型在检测膀胱癌方面优于基于血浆热点的模型（AUC = 0.96 vs. 0.87），显示了片段组学在泌尿系统癌症检测中的巨大潜力。

2.1.2 长链cfDNA片段组学

过去被Illumina平台忽略的长cfDNA（>500 bp），在2021年通过PacBio SMRT测序技术被揭示。长cfDNA的价值在于，单个分子通常携带更多的CpG和SNP位点，可以直接确定这些位点的连锁关系（定相），减少对统计推断的依赖，从而理论上可以推断单个长cfDNA分子的组织来源。

长cfDNA的片段组学特性也与短cfDNA不同。研究表明，长cfDNA富集在常染色质区域。在肝细胞癌（HCC）患者中，映射到肿瘤中高表达基因的长cfDNA分子丰度显著高于健康对照组和HBV携带者，能够有效区分HCC患者（AUC=0.898）。其产生机制可能与DFFB核酸酶有关，因为DFFB敲除小鼠中TSS附近的长cfDNA比例显著下降。长cfDNA末端密度在CTCF结合位点和DNase I超敏位点处急剧增加，因此长cfDNA片段组学可能有助于描绘癌症中染色质组织的特定异常模式。

然而，长读长测序应用于cfDNA仍面临挑战，主要是测序通量低和样本起始量要求高，这限制了从大量片段中获取高维度特征信息的能力。

2.2 从片段组学解码表观遗传与转录信号

片段组学的另一个前沿是研究其与表观遗传信息（甲基化组、转录组和染色质结构）的关系。由于这些信息具有组织或肿瘤特异性，单一的片段组学检测有潜力推断丰富的表观遗传信息，从而直接实现癌症的检测和溯源，而无需进行有损、复杂或低产的实验（如亚硫酸氢盐测序、ChIP-seq或RNA-seq）。

2.2.1 预测DNA甲基化状态

FRAGMA (FRAGmentomics-based Methylation Analysis)

研究发现，CpG位点周围的cfDNA片段化模式与其甲基化状态定量相关。在甲基化的胞嘧啶处，切割频率比未甲基化的高2倍。利用这些切割比率，支持向量机（SVM）模型能够以96%的特异性区分HCC和非HCC个体（AUC=0.98）。此外，一个卷积神经网络（CNN）可以利用CpG位点两侧各5个核苷酸的切割模式，稳健地预测CpG甲基化状态（AUC=0.93）。

FRAGMAXR (FRAGMA to an eXtended genomic Region)

该方法将FRAGMA应用于扩展的基因组区域。研究发现，在差异甲基化位点（DMSs）处，cfDNA覆盖度呈现出与甲基化状态相关的反相核小体周期性。癌症患者中这种周期性振幅减弱。利用这些周期性特征训练的SVM分类器在区分HCC和非HCC受试者方面取得了0.93的AUC，优于传统的片段大小和基序多样性评分。FRAGMAXR在检测肺癌、乳腺癌和卵巢癌方面也表现出色。

2.2.2 预测特定组蛋白修饰

FRAGHA (Fragmentomics-based Histone Modification Analysis)

该研究假设特定的组蛋白修饰与特征性的片段化模式相关。例如，在H3K27ac（一种转录激活信号）位点，片段大小和末端基序频率会发生特征性改变。这些改变与H3K27ac信号强度呈强对数线性关系，使得通过片段大小和末端基序推断血浆H3K27ac水平成为可能。结合这两者训练的SVM模型在区分HCC和非HCC病例中也取得了高准确率（AUC=0.93-0.97）。

2.2.3 高阶染色质结构与转录特征

通过cfDNA测序可以推断核小体定位。由于活性基因启动子处存在核小体耗尽区，我们可以通过分析TSS和TF结合位点周围的核小体占据情况来推断基因表达水平，从而检测癌症中的异常转录活性。例如，TSS周围的片段大小多样性可以参数化基因表达水平，用于非小细胞肺癌的检测（AUC=0.91）和亚型分类（AUC=0.90）。

此外，通过检查组织特异性表达基因启动子区域的核小体占据数据，可以解析cfDNA的组织来源。最近，高分辨率单细胞转录组数据集使得在低至0.3x的测序深度下，就能将cfDNA推断的核小体足迹数据解构成超过490种细胞类型，并成功检测到多种癌症中异常的细胞类型贡献。

最近的研究还发现，即使在1-2x的测序深度下，通过比较TSS周围的片段大小，也能观察到活性和沉默基因之间延伸至500kb的微小差异，这表明长程染色质组织的调控可以被表征。

这些方法对于揭示癌症生物学的新机制，特别是在早期肿瘤发生中，具有巨大潜力。例如，对Li-Fraumeni综合征（携带胚系TP53突变）患者的全面片段组学分析显示，无论是否患癌，TP53突变携带者都表现出多种类似癌症的片段组学变化，如染色质可及性增加和AT富集末端基序的富集。这表明高分辨率片段组学能够捕捉到特定生物学背景下肿瘤发生的根本机制。

MERGE模型是一个集大成的例子，它整合了多种表观遗传-片段组学方法用于肺癌检测。该模型首先利用cfChIP-seq、cf-RRBS和染色质可及性谱定义了“多重表观遗传调控基因”（MERGEs），然后在这些区域内提取片段大小、末端基序等特征，训练了一个集成模型。该模型实现了0.94的AUC，并能有效区分肺癌与良性肺结节，展示了其在可疑肺结节筛查中的应用潜力。

2.3 探索新的片段组学机制

尽管许多关于cfDNA产生和清除的问题仍未解决，但我们有理由对发现更多调控cfDNA片段组学的机制持乐观态度。

2.3.1 cfDNA片段组学癌症检测新计算方法

片段组学特征的高维性需要精心设计的人工智能（AI）和机器学习（ML）方法来释放其全部潜力。

DELFI (DNA evaluation of fragments for early interception) 算法是一个杰出代表。它利用全基因组5 Mb窗口内短片段（100-150 bp）与长片段（151-220 bp）的比率，构建了一个梯度提升算法，用于检测和溯源七种不同的癌症。DELFI已被广泛应用于多种癌症的诊断、分类和预后预测。

最近，基于Transformer的AI，如大语言模型（LLM），被用于分析标记化的末端基序“句子”。

然而，这些方法也存在局限性：

  1. iLLMAC 使用的是为自然语言设计的模型架构，可能不完全适合基因组序列。
  2. EMIT 虽然是针对cfDNA末端基序预训练的，但它只使用了部分基序，并且通过排序丢弃了频率的数值信息和片段的基因组位置信息，可能导致信号损失。

2.3.2 多模态片段组学分析

为了整合各种片段组学标志物，研究人员开始探索多模态模型架构，通常使用堆叠（stacking）算法，将多个不同分类器的预测结果与一个元学习器（如广义线性模型）结合起来。

尽管多模态分析在理论上有优势，但对于极早期癌症，其性能提升往往是渐进的。这可能是因为早期肿瘤释放的cfDNA信号太弱。因此，模型的复杂性并非越高越好，必须结合疾病的特定生物学背景来选择特征。例如，在区分尤文氏肉瘤和其他肉瘤时，单一的DHS覆盖度特征就胜过了复杂的多模态模型。

3. 临床试验

尽管前景广阔，但片段组学方法的真正临床价值需要通过大规模、多中心临床试验证实。以下是一些代表性的临床试验。

3.1 癌症检测与溯源

3.2 治疗监测与风险预测

片段组学方法在无需预先知道肿瘤突变信息的情况下，为治疗监测提供了新工具：（上）DELFI可用于估算肿瘤分数，监测微小残留病和癌症复发。（下）多模态片段组学方法可用于对EBV DNA阳性但无症状的个体进行鼻咽癌未来发病风险分层，从而指导筛查和预防策略。