使用深度学习从纳米孔数据中检测植物基因组范围的胞嘧啶甲基化.

• paper：Genome-wide detection of cytosine methylations in plant from Nanopore data using deep learning

0. TL; DR

DeepSignal-plant 是一个利用深度学习从纳米孔 reads 中检测植物全基因组中 CpG, CHG, CHH 全部三种上下文 5mC 甲基化的深度学习工具。

作者在拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 和水稻 (Oryza sativa) 上进行了纳米孔和亚硫酸氢盐测序，并以此为基础训练和评估模型。结果显示，DeepSignal-plant 的预测结果与金标准高度相关。此外，在未经训练的黑芥 (Brassica nigra) 数据集上的测试也取得了高相关性，证明了其强大的泛化能力。

1. 背景介绍

胞嘧啶 DNA 甲基化 (5mCs) 作为主要的 DNA 甲基化形式之一，在调控植物的基因表达、转座子沉默、果实发育和胁迫响应等生物学过程中扮演着重要角色。

在植物中，5mCs 可以发生在三种不同的序列上下文中：CpG, CHG 和 CHH（其中 H=A, C 或 T）。这三种类型的甲基化在功能上有所不同。例如，CpG 甲基化主要存在于基因体；CHG 甲基化在沉默转座子方面作用更大；而 CHH 甲基化对于沉默 CpG 和 CHG 耗尽的转座子至关重要。因此，在全基因组范围内检测所有三种上下文的 5mC 甲基化非常重要。

亚硫酸氢盐测序 (Bisulfite sequencing) 是目前最广泛使用的 5mC 检测方法，但它也存在一些局限性，如无法分析基因组的重复区域，以及在处理过程中可能导致 DNA 降解等。

纳米孔 (Nanopore) 等第三代测序技术能够直接对天然 DNA 进行测序，无需化学转化或 PCR 扩增，从而为直接检测碱基修饰提供了新的机会。已有一系列计算方法被开发出来用于从纳米孔数据中检测 5mC。

• 基于统计学的方法：如 Tombo，通过比较天然 DNA 和无甲基化 DNA 的信号差异来推断甲基化，但通常假阳性率较高。
• 基于模型的方法：如 nanopolish, DeepSignal，它们使用隐马尔可夫模型 (HMM) 或深度神经网络来预测特定基序（如 CpG）中的修饰，准确率较高。
• 基于碱基检出的方法：如 Megalodon，在碱基检出 (basecalling) 过程中直接识别修饰碱基。

然而，据作者所知，目前还没有任何一种方法能够利用第三代测序数据，准确地分析植物全基因组中所有三种上下文的 5mCs。

为此，作者开发了 DeepSignal-plant，一个旨在利用深度学习从天然纳米孔 reads 中，准确检测植物中 CpG, CHG, CHH 全部三种上下文 5mC 的工具。

2. DeepSignal-plant方法

2.1 数据集

作者对两种模式植物拟南芥 (A. thaliana) 和水稻 (O. sativa) 进行了并行的纳米孔测序和亚硫酸氢盐测序。

• 亚硫酸氢盐测序：作为“金标准”，用于构建训练模型所需的高置信度甲基化和未甲基化位点。
• 纳米孔测序：用于提取原始电信号，作为模型的输入。

2.2 DeepSignal-plant 的框架

DeepSignal-plant 的核心是一个利用双向循环神经网络 (bidirectional recurrent neural network, BRNN) 和长短期记忆 (LSTM) 单元的深度学习模型，它能够从纳米孔测序的信号和序列特征中检测 DNA 5mC 甲基化。

DeepSignal-plant 的框架主要包括特征提取、模型架构和模型训练三个部分。

2.2.1 特征提取

在对原始 reads 进行碱基检出 (basecall) 和重摆动 (re-squiggle)（即信号与碱基的对齐）预处理后，对于每个待预测的胞嘧啶位点，作者提取两种类型的特征：

1. 序列特征 (Sequence features)：以目标位点为中心，构建一个 $k \times 4$ 的矩阵（默认 $k=13$）。对于 k-mer 中的每一个碱基，提取四个特征：核苷酸本身、映射到该碱基的信号值的均值、标准差和数量。
2. 信号特征 (Signal features)：从 k-mer 中每个碱基的所有信号中，采样 $m$ 个信号（默认 $m=16$），构成一个 $k \times m$ 的矩阵。

2.2.2 模型架构

DeepSignal-plant 的模型是一个基于 BRNN 和 LSTM 单元的神经网络。

序列特征和信号特征被分别送入两个独立的 BRNN 层和一个全连接层。两个分支的输出特征被拼接起来。拼接后的特征被送入一个三层的 BRNN 和两个全连接层。最后，一个 softmax 激活函数输出该位点被甲基化（$P_m$）和未被甲基化（$P_{um}$）的概率。

2.2.3 模型训练

DeepSignal-plant 的训练过程需要解决训练样本严重不平衡和含有噪声的问题。

由于在植物中，尤其是 CHH 上下文中，完全甲基化的位点远少于完全未甲基化的位点，直接训练会导致模型偏向于预测“未甲基化”。作者设计了一个算法，通过在k-mer 水平上对负样本进行欠采样 (subsample)，来平衡训练集中每个 k-mer 的正负样本数量。

由于高置信度的甲基化位点是基于“甲基化频率>0.9”来定义的，这不可避免地会引入一些假阳性样本。为此，作者设计了一个迭代式的去噪 (denoising) 算法。在每次迭代中，通过交叉预测 (cross prediction)（即将训练集随机分成两半，用一半训练的模型去预测另一半），找出那些被错误地预测为“未甲基化”的阳性样本。将这些可能被错误标记的样本从训练集中移除。重复这个过程，直到被移除的阳性样本比例小于1%或达到最大迭代次数。

3. 实验分析

作者对 DeepSignal-plant 的性能进行了全面的评估，包括其去噪策略的有效性、与现有方法的比较，以及其在扩展基因组覆盖度方面的优势。

3.1 平衡和去噪方法在 DeepSignal-plant 中的评估

作者首先验证了去噪和平衡策略的有效性。

• 图 c (信号比较): 结果显示，被去噪步骤移除的阳性样本，其电信号特征与阴性样本非常相似，这直观地证明了去噪算法能够有效地识别并移除假阳性样本。
• 图 d (性能提升): 在拟南芥数据集上，与随机选择样本相比，经过平衡和去噪处理后，模型的性能得到了显著提升，尤其是在 CHH 上下文的检测上，与亚硫酸氢盐测序的相关性从0.3696跃升至0.7840。

平衡和去噪策略对于训练一个高性能的、能够准确检测非 CpG 甲基化的模型至关重要。

3.2 DeepSignal-plant 与其他 5mC 检测工具的比较

作者将 DeepSignal-plant 与 Megalodon（ONT 官方的、能够检测所有上下文 5mC 的工具）在三个物种（拟南芥、水稻、黑芥）上进行了性能比较。

• 图 a (拟南芥) 和 图 b (水稻): 在拟南芥和水稻上，DeepSignal-plant 在所有三种上下文（CpG, CHG, CHH）的检测性能上都优于原始的和重新训练过的 Megalodon。
• 图 c (黑芥): 在未经训练的黑芥数据集上，DeepSignal-plant 在 CpG 和 CHH 上下文的检测上同样表现更优，证明了其强大的泛化能力。

3.3 纳米孔测序比亚硫酸氢盐测序分析了更多的胞嘧啶

由于长读长的优势，DeepSignal-plant 能够分析亚硫酸氢盐测序无法覆盖的区域（如重复序列区域）。

• 图 a, b: IGV 浏览器视图清晰地显示，在亚硫酸氢盐测序存在覆盖缺口（蓝色阴影区域）的地方，纳米孔测序仍然有良好的覆盖，并且 DeepSignal-plant 能够成功地调用甲基化状态。
• 图 c, d: Circos 图显示，DeepSignal-plant 单独检测到的胞嘧啶广泛分布于整个基因组，尤其是在着丝粒 (centromeres)、异染色质 (pericentromeric) 和端粒 (telomeres) 区域。

与亚硫酸氢盐测序相比，DeepSignal-plant 在拟南芥和水稻中分别多检测了1.1%和5.3%的 5mCs，尤其是在 CHG 和 CHH 上下文中。这为我们提供了一个更完整的全基因组甲基化图谱。

3.4 重复序列对中的差异甲基化胞嘧啶

作者进一步分析了基因组中片段重复 (segmental duplications) 区域内的甲基化状态。

• 图 a, b: 结果显示，在拟南芥和水稻中，分别有超过9%和6%的重复序列对是差异甲基化 (differentially methylated)的。
• 图 c, d: 有趣的是，不同物种中差异甲基化的模式也不同：拟南芥中 CpG 位点更容易发生差异甲基化，而水稻中则是 CHG 位点。
• 图 f, g: IGV 视图直观地展示了两个重复序列对中，一个区域被高度甲基化，而另一个区域则几乎没有甲基化。

DeepSignal-plant 能够准确地识别重复序列区域中的差异甲基化模式，这为研究重复基因的转录调控和甲基化特征之间的关系提供了新的视角。

综上所述，DeepSignal-plant 通过其优化的深度学习模型和创新的训练策略，成功地解决了植物中全上下文 5mC 甲基化检测的难题，其性能优于现有方法，并能够提供比传统亚硫酸氢盐测序更全面的甲基化图谱。