0. TL; DR

MethylNet 是一个用于 DNAm 的深度学习方法，通过变分自编码器进行预训练，模型能够学习到有意义的生物学特征，能够构建嵌入、进行预测、生成新数据，并在最少的用户监督下揭示未知的异质性。作者的实验结果表明，MethylNet 能够有效研究细胞差异，掌握癌症亚型的高阶信息，估算年龄，并捕捉与吸烟相关的、与已知差异一致的因素。

1. 背景介绍

深度学习已成为一种广泛应用的建模技术，特别是在处理大规模分子数据方面展现出巨大潜力。DNA 甲基化（DNAm）是 DNA 上的一种化学修饰，它不改变序列本身，但能深刻影响基因表达。异常的 DNAm 模式与衰老、环境暴露以及癌症等多种疾病的发生发展密切相关。

目前，全表观基因组关联研究 (EWAS) 是分析 DNAm 与表型关联的主要方法。然而，DNAm 数据具有高维度（数十万个 CpG 位点）、连续值（beta 值在0-1之间）和多重共线性等特点，给传统统计分析带来了巨大挑战，如多重假设检验校正。为了应对这些挑战，许多研究都聚焦于降维和特征选择。

变分自编码器 (Variational Auto-encoders, VAE) 的应用是甲基化深度学习分析的一个重要进展。VAE 能够将高维的甲基化谱嵌入到一个低维的潜在空间中，这种表示既能高度保真地重构原始数据，又能揭示数据中的细微差别。然而，现有的基于 VAE 的方法仍然存在一些局限性：

对超参数敏感：VAE 模型的性能高度依赖于超参数的选择。
缺乏端到端的预测：许多方法只是用编码器提取特征，然后将这些特征输入到另一个非神经网络模型（如支持向量机）中进行预测，而不是一个端到端的训练过程。
功能有限：现有框架大多不支持多目标回归任务，如细胞类型解卷积和年龄预测。

为了解决这些问题，作者开发了 MethylNet，一个模块化的、用户友好的深度学习框架。它通过一个自动化的工作流，简化了深度学习在甲基化数据分析中的应用，并扩展了其功能，使其能够处理多种常见的 EWAS 任务。

2. MethylNet 方法

MethylNet 的核心是一个模块化的框架，它通过一系列简单的命令行指令，将复杂的深度学习流程自动化，主要包括特征提取器的训练、预测模型的训练和结果的解释三个步骤。

2.1 框架描述

MethylNet 的流程如图所示，它是一个端到端的解决方案，从数据预处理到最终预测和解释。

2.1.1 训练特征提取器以嵌入数据

这一步是无监督学习过程，旨在学习数据的有意义的低维表示。使用变分自编码器。VAE 由一个编码器 (encoder) 网络和一个解码器 (decoder) 网络组成。编码器将输入的甲基化数据压缩到一个潜在空间表示，解码器则尝试从这个潜在表示中重构出原始数据。

VAE 的训练目标是平衡两个方面：重构能力（确保潜在表示能准确地描述原始信号）和生成能力（通过从潜在分布中采样来生成新的、真实的合成数据）。在训练过程中，生成合成样本可以作为一种正则化手段，使模型对真实世界的数据更具泛化能力。

通过 perform_embedding 命令执行。框架还提供了 launch_hyperparameter_scan 命令，用于自动搜索最优的模型超参数（如网络结构、学习率等），并选择在验证集上具有最低损失（重构损失 + KL散度损失）的模型。

2.1.2 通过迁移学习进行预测训练

在获得了能够有效表示数据的编码器之后，MethylNet 进入有监督学习段，用于执行具体的预测任务。这一步采用了迁移学习技术。具体来说，作者将在上一步预训练好的 VAE 的编码器层拿过来，并在其后附加几个新的隐藏层用于预测。在训练过程中，编码器层和新的预测层会同时进行微调。这种方法利用了从无监督学习中获得的“知识”，使得模型在有监督任务上能用更少的数据达到更好的性能。

MethylNet 支持多种预测任务，包括分类、回归和多目标回归，只需通过一个命令行选项即可切换。

通过 make_prediction 命令执行。同样，可以使用 launch_hyperparameter_scan 来优化预测模型的超参数。最终模型是基于在验证集上最低的损失（回归任务为均方误差，分类任务为交叉熵）来选择的。

2.1.3 结果的解释

为了打开深度学习的“黑箱”，MethylNet 提供了两种解释其预测结果的方法。

SHAP (SHapley Additive ExPlanation)：这是一种模型解释方法，它通过为每个预测构建一个简单的线性模型来近似复杂的神经网络模型。线性模型的系数（Shapley values）代表了每个 CpG 位点对该预测的贡献度。通过 produce_shapley_data 命令可以计算这些值。
嵌入聚类：通过对模型学习到的样本嵌入进行聚类分析，可以直观地检验模型是否捕捉到了符合生物学预期的样本间关系（如不同癌症亚型之间的远近）。

3. 实验分析

作者在六个公开的 DNAm 数据集上展示了 MethylNet 在多种任务中的能力，包括年龄预测、细胞类型解卷积、泛癌亚型分类和吸烟状态预测。

3.1 年龄预测结果

图 a: 作者在一个包含健康人血液样本的数据集上训练 MethylNet 来预测年龄。在留出的测试集上，MethylNet 预测的年龄与个体的真实年龄表现出极好的一致性（$R^2 = 0.96$），其性能与经典的 Horvath 和 Hannum 甲基化时钟相当。
图 b: MethylNet 的平均绝对误差 (mean absolute error) 仅为3.0年，同样与其他时钟的准确度不相上下。
图 c: 作者使用 SHAP 值分析了对不同年龄组（以10年为间隔）预测贡献最大的 CpG 位点。通过将这些 CpG 与 Hannum 时钟的 CpG 进行重叠分析，发现 MethylNet 找出的重要 CpG 在60-80岁年龄段与 Hannum 时钟的重叠度最高，这与 Hannum 时钟原始训练队列的年龄分布相符。
图 d: 对不同年龄组的 SHAP CpG 分数进行层次聚类 (hierarchical clustering)，结果显示，年龄相近的组别聚在了一起。这表明 MethylNet 学习到的年龄相关特征是符合生物学规律的，即相似的年龄段共享相似的驱动性 CpG。

3.2 细胞类型解卷积结果

作者使用 MethylNet 来估算血液样本中六种免疫细胞的比例。与使用 IDOL 文库的 EpiDISH 估计方法相比，MethylNet 在几乎所有细胞类型上都取得了优异的性能（以 $R^2$ 和平均绝对误差 (mean absolute error) 衡量）。

对不同细胞类型预测的 SHAP CpG 贡献分数进行层次聚类，结果清晰地重现了已知的细胞谱系树。例如，淋巴细胞（B细胞, CD4T, CD8T, NK细胞）聚在了一起，而髓系细胞（单核细胞, 中性粒细胞）聚在了另一支。这再次证明了 MethylNet 捕捉到的特征与已知的生物学知识高度一致。

3.3 泛癌亚型预测结果

作者将 MethylNet 应用于一个包含32种癌症亚型的 TCGA 泛癌队列，进行亚型分类。结果显示，MethylNet 取得了高达0.97的准确率 (accuracy)、精确率 (precision)、召回率 (recall) 和 F1-score，其性能显著优于一个基于 UMAP+SVM 的方法（F1-score 提高了0.15）。

对模型为不同癌症亚型学习到的平均嵌入进行层次聚类，结果形成了八个与已知的组织来源和癌症生物学高度一致的“超类”。例如，所有肾癌聚在了一起；结肠癌和直肠癌配对；不同类型的脑癌聚在了一起。样本的误分类也主要发生在这些超类内部，例如，一些低级别胶质瘤被误分类为胶质母细胞瘤。