通过深度神经网络从单细胞转录组插补表面蛋白.
0. TL; DR
cTP-net是一个迁移学习框架，利用现有的单细胞多组学资源进行学习，能够从scRNA-seq数据中推断出细胞表面蛋白的丰度。
通过在多个基准数据集（如PBMC、CBMC）和应用案例（如人类细胞图谱和急性髓系白血病数据）上的全面评估，作者证明了cTP-net的性能优于现有方法。它能够准确地推断出24种免疫表型标志物，从而比单独使用转录组测量能更详细地表征细胞状态和表型。cTP-net为那些只有转录组数据的研究提供了获取关键蛋白质信息的新途径。
1. 背景介绍
近年的技术进步使得在同一个细胞内同时分析多种组学特征成为可能。特别是，通过REAP-seq和CITE-seq等技术，现在可以高通量地量化同一个细胞的转录组和一组选定的细胞表面蛋白。
细胞表面蛋白可以作为特定细胞功能的关键标志物和治疗干预的主要靶点。通过细胞表面蛋白进行的免疫分型在过去30年中一直是血液学、免疫学和癌症研究中不可或缺的工具。然而，由于技术障碍和成本考虑，包括“人类细胞图谱”（Human Cell Atlas）项目在内的大多数单细胞研究仅量化了转录组，而没有相应细胞的表面蛋白测量数据。通常，只有在通过scRNA-seq进行探索后，哪些细胞类型和相应的表面蛋白是至关重要的才会变得明朗。
这就引出了一个问题：是否可以从一个细胞的转录组中准确地推断出其蛋白质丰度？
为了回答这个问题，作者提出了cTP-net，一个基于深度神经网络的迁移学习方法，用于从scRNA-seq数据中推断表面蛋白的丰度。cTP-net依赖于不断积累的、包含配对转录组和表面蛋白测量的公共数据进行模型训练。通过这种方式，它可以将从一个数据集中学到的知识“迁移”到另一个只有scRNA-seq数据的数据集中，从而实现跨组学的预测。
2. cTP-net框架
cTP-net的分析流程主要包括两个步骤：scRNA-seq数据去噪和基于去噪数据的蛋白质丰度推断。
2.1 步骤一：scRNA-seq数据去噪
由于单细胞测序数据固有的高稀疏性和技术噪声（如dropout），直接使用原始计数矩阵进行预测效果不佳。因此，cTP-net首先使用SAVER-X对原始的scRNA-seq计数矩阵进行去噪。SAVER-X是一种基于深度学习的迁移学习去噪方法，能够为每个细胞提供更准确的RNA转录本相对丰度估计。
实验表明，与原始计数相比，去噪后的基因相对表达值与相应蛋白质丰度的相关性显著提高。
2. 步骤二：多分支深度神经网络（MB-DNN）推断
尽管去噪能提升相关性，但对于某些蛋白质（如CD45RA），其RNA与蛋白质水平的关联仍然非常弱。这背后有复杂的原因，包括转录后修饰、翻译调控、翻译后修饰和蛋白质运输等一系列生物过程。这些过程都受到细胞状态和其他基因活性的影响。
为了学习从一个细胞的整个转录组到一组特定表面蛋白丰度的复杂映射关系，cTP-net采用了一个多分支深度神经网络（Multiple Branch Deep Neural Network, MB-DNN）。
模型架构
MB-DNN的结构如图所示。
网络的前几层是共享的。输入是去噪并标准化的全基因表达谱（维度为基因总数D）。这些共享层（第一层1000个节点，第二层128个节点）旨在学习跨所有蛋白质都通用的特征，例如细胞类型、细胞状态以及细胞周期等共同的生物过程。
在共享的瓶颈层（128个节点）之后，网络分叉成多个独立的分支，每个分支对应一个待预测的表面蛋白。每个分支都有一个64个节点的隐藏层，最终连接到一个单节点的输出层，该输出层给出相应蛋白质的推断丰度。
除最后一层外，所有全连接层都使用ReLU激活函数。最后一层是恒等激活函数，用于输出连续的蛋白质丰度值。
训练过程
网络的输入是经过SAVER-X去噪和对数标准化（LogNormalize）的基因表达矩阵$X$。目标输出是经过中心化对数比（CLR）变换的蛋白质丰度矩阵$Y$。
模型优化的目标是最小化预测值与真实值之间的L1范数（L1 norm）。
\[\underset{F}{\text{argmin}} || Y - F(X) ||_1\]其中，$F$代表整个cTP-net网络。使用Adam优化器进行随机优化。
这种多分支的设计使得模型能够同时学习共享的细胞状态信息和每个蛋白质特有的调控模式。
3. 实验分析
作者通过一系列基准评估和应用案例，全面地验证了cTP-net的性能。
3.1 推断准确性评估：随机留出法
在CITE-seq和REAP-seq数据集上，将90%的细胞作为训练集，剩余10%作为验证集，以评估模型在与训练数据细胞类型完全匹配的理想情况下的性能。
对于所有被检测的蛋白质（如CD3, CD4, CD8），cTP-net推断的蛋白质丰度与实验测量的蛋白质水平的相关性，远高于原始RNA计数或去噪后的RNA计数。这表明cTP-net成功学习到了超越单个基因表达的复杂映射关系。
3.2 泛化能力评估：跨细胞类型、组织和技术平台
实验设置：
- 跨细胞类型：将某一特定细胞类型的所有细胞作为测试集，用剩余所有细胞类型训练模型，然后对被留出的细胞类型进行预测。
- 跨组织：在CBMC（脐带血单核细胞）上训练模型，然后在PBMC（外周血单核细胞）上进行预测，反之亦然。
- 跨技术平台：在CITE-seq数据上训练模型，然后在REAP-seq数据上进行预测，反之亦然。
cTP-net在所有这些迁移学习场景中都表现出良好的泛化能力。即使对于训练中未见过的细胞类型，其预测结果的相关性仍然显著高于直接使用RNA计数。推断出的蛋白质丰度与真实值的相关性也远高于对应的RNA表达水平。这表明cTP-net学习到的转录组-蛋白质映射关系具有普适性，不完全依赖于训练和测试集之间细胞类型的完美重叠。
3.3 与Seurat v3的性能比较
将cTP-net与当时最先进的跨模态数据整合方法Seurat v3 anchor transfer进行比较。
在标准的验证集上（validation），cTP-net和Seurat v3的性能相当，cTP-net略优。在更具挑战性的跨细胞类型预测场景中（across cell type），cTP-net的性能远超Seurat v3。这是因为cTP-net学习了一个直接的映射函数，而Seurat v3依赖于在训练集中找到近邻，当测试集是新细胞类型时，这种方法会失效。
在捕捉同一细胞类型内部的蛋白质丰度异质性方面，cTP-net也优于Seurat v3。
- 图b的散点图显示，在许多“细胞类型-蛋白质”对中，cTP-net的细胞内相关性（y轴）高于Seurat v3（x轴）。
- 图c展示了三个具体的例子，如在CD14-CD16+单核细胞中对CD11c的预测，cTP-net能更好地捕捉其在细胞间的变化。这使得cTP-net在发现和标记更精细的细胞状态方面具有潜力。
3.4 应用案例一：人类细胞图谱（Human Cell Atlas）
将在多个免疫细胞数据集上联合训练好的cTP-net模型，应用于“人类细胞图谱”项目中的CBMC和BMMC（骨髓单核细胞）scRNA-seq数据，推断24种免疫标志物的表面蛋白丰度。
- 图a-e：推断出的蛋白质水平与原始RNA表达截然不同，它在不同细胞类型间显示出更高的对比度，在同一细胞类型内则表现出更高的一致性。这使得推断的蛋白质谱成为识别和标记细胞状态的、更清晰可解释的特征。例如，推断的CD4/CD8水平清晰地分开了CD4+和CD8+ T细胞；推断的CD45RA/CD45RO水平则能区分幼稚T细胞和记忆T细胞。
- 图f, g (揭示细胞内梯度)：在NK细胞中，cTP-net的预测揭示了CD56和CD16蛋白水平之间存在一个相反的梯度（Spearman cor = -0.47），这对应了已知的CD56bright和CD56dim两个功能亚群。这种模式在原始的RNA数据中由于表达量过低而无法观察到。这一发现证明cTP-net能够揭示被转录组噪声掩盖的生物学信号。
3.5 应用案例二：急性髓系白血病（AML）
将cTP-net应用于一个包含16名AML患者样本的scRNA-seq数据集，推断免疫表型标志物，以确定恶性细胞的起源和分化阶段。
- 图a, b：基于推断的蛋白质丰度生成的UMAP图清晰地重现了正常的髓系分化轨迹，从CD34+祖细胞到成熟的CD14+单核细胞。而基于转录组的可视化则受到严重的批次效应影响。
- 图c, e, f：推断的蛋白质谱能够将不同AML患者的恶性细胞定位到分化轨迹上的不同阶段，从而将患者分为“单一分化阶段”、“两个分化阶段”和“多个分化阶段”三类，这与原始研究的结论一致。
- 图d (揭示疾病特异性标志)：对于携带RUNX1/RUNX1T1融合基因的AML707B患者，其恶性细胞在推断的CD38蛋白水平上表现出异常增高。这一现象已被文献报道，并提示CD38可能是该亚型AML的潜在治疗靶点。
即使cTP-net仅在正常免疫细胞上进行训练，它依然能够为AML的恶性细胞推断出有意义的免疫表型，并揭示与疾病相关的特异性标志，这些信息对于表征肿瘤表型和指导治疗具有重要价值。
